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中国试剂网 3.23.23 直接点样的芯片制备技术 直接点样法最早由Stanford 大学Brown 实验室发展而来，是将微量的寡聚核苷 酸片段、cDNA 或蛋白质等通过特定的高速点样机器人直接排列到玻片等介质 上，生物大分子探针通过共价键或离子键与特殊处理的玻片相连，从而制备成芯 片。直接点样法主要包括3 个重要的环节：探针的准备，载体的表面修饰和点样。 1 ．探针的准备 根据实验的目的，选择相应的探针及种类，基因芯片的探针主要有寡核苷酸 或cDNA 。对于寡核苷酸探针，探针的设计是很关键的一个环节，需要根据研究 目的设计相应的探针序列，如 SNP 分析芯片，必须考虑待检测位点的序列和位 置，需要严格控制探针的Tm 值。如果用于表达谱的研究，目的基因的寡核苷酸 探针设计原则是尽量使探针与其他基因之间没有同源性，即探针的特异性要好。 探针设计完成后，目前有商业化公司可以进行人工合成。 对于cDNA 芯片，需要预先克隆到大量目的基因的cDNA 克隆，并经过测序 验证。用PCR 进行探针的扩增，经过纯化后，即可用于点样。 对于蛋白质芯片，探针的制备是一个很大的瓶颈，需要预先准备大量的有活 性的探针。主要有几种方式：一是人工合成多肽探针，虽然效率较高，但其活性 与完整蛋白质可能存在很大区别；二是用基因工程的手段制备蛋白质探针，将目 的基因构建到原核或真核蛋白质表达系统中，在宿主细胞中表达，经过纯化后制 备探针；三是针对抗体芯片，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，纯化后用于芯片 制备。 蛋白质要预处理，因为DNA 相对与蛋白质来说比较稳定，因此所有DNA 探 针只需简单的纯化后就能直接溶于点样液中直接点样。而不同的蛋白质探针的性 质差异很大，稳定性也差，通常用来制备芯片的蛋白质最好具有较高的纯度和完 好的生物活性，所以点样前必须选择合适的缓冲液将蛋白质溶解。一般是采用含 40 ％甘油的PBS 缓冲液，一则可以防止溶液蒸发，使蛋白质在芯片的整个制作 过程中均保持水合状态；再则该缓冲液可有效防止蛋白质变性，从而维持其生物 活性。蛋白质预处理完毕即可加入样品槽中进行点样。 2 ．玻片的表面修饰 对于DNA 芯片，点样法所用载体多为玻璃片，其与多孔尼龙膜相比具有杂交 中国试剂网 3.23.23 体积小、荧光背景低、支持同时使用两种或两种以上荧光素。其他可用的固相载 体还有硝酸纤维膜、活化葡聚糖凝胶、琼脂糖、甲基丙烯酸共聚物、丙烯酰胺、 聚苯乙烯等，大多因较强荧光背景、化学和物理稳定性差、固定DNA 片段的一 致性较差和不易提高密度等原因而很少使用。 在点样前，一般先对载体表面进行化学修饰(如多聚赖氨酸或硅烷偶联剂等) ， 使其表面富含氨基并带正电。修饰后的固相载体表面可利用静电吸附带负电的 DNA 或蛋白质探针，或通过双功能偶联试剂(如戊二醛)辅助形成共价化学键而连 接。 玻片表面的修饰方法很多，如 3—氨丙基三甲氧基硅烷对玻璃表面进行氨基 化，氨基与l，4—苯二异硫氰酸盐发生反应，使玻片表面连接上可以与氨基反应 的异硫氰酸基团，5 氨基修饰的寡核苷酸与异硫氰酸基团反应，从而将探针连接 在芯片上。Rogers 研究了将末端二硫键修饰的寡核苷酸共价交联到巯基硅烷化玻 璃表面的可行性。玻片先用3—巯丙基硅烷衍生化，与5 端二硫键化合物修饰的 寡核苷酸发生巯基置换反应进而交联。此外，Livaehe 等利用吡咯在电化学条件 下发生氧化聚合的原理，以微电极阵列为基础制备寡核苷酸芯片。通电时，5 吡咯修饰的寡核苷酸及吡咯在微电极上发生聚合，聚合物的合成区域限制在电极 表面，通过切换微电极的通电情况选择定位各种寡核苷酸探针。 对于蛋白质芯片，常用载体有膜载体和载玻片。膜载