第十一篇荧光分析法.ppt

概述 分子发光（molecular luminescence） 某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后，返回基态的过程中伴随发光的现象。 同步扫描技术 各类光谱仪的结构 第十章 紫外可见分光光度法 1.电子跃迁类型？这些类型的跃迁吸收峰各处于什么范围？ 2.基本概念：生色团、助色团；红移、蓝移；增色效应、减色效应；强带、弱带 3.什么是R 、K 、B、E带？各有何特点 4.影响吸收带的因素 5.偏离比尔定律的因素及吸光度最适测量范围 6.紫外可见分光光度计的基本组成及特点 7.举例说明紫外吸收光谱在分析上有哪些应用 5.散射光 瑞利光：弹性碰撞，不发生能量交换，仅改变方向， 波长与入射光相同 拉曼光：非弹性碰撞，改变方向同时能量交换，波长 长移或短移。 散射光对荧光测定有干扰 尤其是波长与荧光波长接近的拉曼光 选择适当的溶剂和激发波长，可消除拉曼光的干扰 320 360 448 350 448 320 360 350 400 激发320nm 硫酸奎宁 激发350nm 硫酸奎宁 激发320nm 0.1mol/LH2SO4 激发350nm 0.1mol/LH2SO4 强度 强度 λ/nm λ/nm 第二节 荧光定量分析方法 一、 特点 1.灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：10-10～10-12g/ml 2.选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； 3.试样量少 缺点：应用范围小。 二、定量依据与方法 1.定量依据 荧光强度F正比于吸收的光强（I0－I） 浓度很低时(Ecl≤0.05) ，将括号项近似处理后： 2.定量方法 1）标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标 准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强 度，在标准曲线上求出浓度； 2）比例法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度 3）多组分样品的荧光分析 a无相互干扰，分别测定 b有干扰，同紫外－可见吸收光谱定量方法 解联立方程组法 等吸收双波长消去法 第三节 荧光分光光度计 1.测量荧光的仪器主要由四个部分组成： 激发光源、双单色器系统、样品池、检测器。 2.特殊点：有激发和发射两个单色器，光源与检测器通 常成直角。 3.光源：氙灯（250-700nm） 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光 (测量)波长的第二单色器； 样品池：石英比色皿 检测器：光电倍增管。 2.仪器的校正 （1）灵敏度校正： 最低信号、最低信噪比所对应的浓度 1μg/ml硫酸奎宁作对照品溶液。 （2）波长校正 汞灯的标准谱线校正 （3）光谱的校正 其他荧光分析技术（自学） 1.激光荧光分析 单色性极好，提高荧光分析的灵敏度和选择性 2.时间分辨荧光分析 利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，实现分别检测的目的。选择合适的延缓时间，可测定被测组分的荧光不受其他组分的荧光及噪声影响 时间分辨荧光免疫分析技术 根据荧光产生时间和衰减速率的差异。对不同组分进行分析 3.同步荧光分析 选择Δλ（通常 ），同步变化发射波长和激发波长进行扫描，得到同步荧光光谱（荧光强度与波长的图谱） 特点：谱图简化、选择性提高、光散射干扰减少 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差(??)和固定能量差及可变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率； 如图。 合适的??可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但??15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱； ??60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。 4.胶束增敏荧光分析 当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度， 会缔合为球状胶束， 利用胶束溶液对荧光物质有增溶、增敏和增稳的作用，对荧光物质进行保护 荧光分析法的应用 1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催