W037-CLIACAP_二代测序临床检测标准操作指南.pdf

CLIA/CAP 二代测序临床检测标准操作指南 2015-04-23 自由度 本临床二代测序操作指南来自于Clinical Laboratory Improvement  Amendments (CLIA) of 1988/College of American Pathologists (CAP)  laboratory。 释义：Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988 ：美国临 床实验室改进修正法规’88 。这个法规里面有关于医学检验项目的一些质量规范， 中国的临床行业很多项目的指标都参考过 CLIA’88 中的内容。 College of American Pathologists (CAP) laboratory：美国病理学家协会。 相较于Sanger测序，二代测序技术（新一代测序技术，NGS）拥有高通 量和低单碱基成本的特点，这使其在临床检测领域拥有得天独厚的优势。过去的 数年间，相当数量的NGS服务商迅速成长，而美国病理学家协会却没有及时依 照美国临床实验室改进修正法规（CLIA）编制指南来规范这个检测。 基于NGS平台的临床检测是一种新的检测方式，相较于原有检测方法，其 复杂程度大大提高，因此迫切需要一个规范标准来指导各实验室进行检测。 CAP于2011年成立了NGS工作部门，商讨NGS临床检测实验检查表的 内容。本次CAP列出共计18条实验室要求的检查表，包含检测的二代测序实 验过程和生物信息学分析过程。 二代测序技术（NGS）包含两个部分：实验操作部分（wet bench）和生 物信息分析部分（dry bench）。实验操作部分包括以下部分或所有的流程：病 例样本的采集处理、核酸提取、片段化、生物分子标签（barcode）、目标区段 /基因捕获富集、连接、扩增、文库构建、上机测序、数据产出。生物信息分析 部分主要依赖于高性能的计算机和不同的生物信息分析方法，主要流程包括：参 考序列比对、组装、变异检测、注释、临床解释（依赖于是否运用诊断工具）。 CAP依据NGS实验操作部分和生物信息分析部分分别建立了独立执行标 准和检测事项：实验操作部分检测条目包括标准操作流程文件的建立、流程验证、 质量管理体系、数据可靠性验证、异常情况记录及维护更新；生物信息分析部分 检测条目包括：变异结果描述、附带结果的报道、数据储存、版本可追溯性及数 据传输安全性。 实验操作部分 实验操作标准操作流程文件 NGS实验室需要建立一个标准操作流程文件用来指导产生NGS实验数据 对于临床实验室来说，一个详细的NGS实验标准操作流程文件是实验室质 量评估的一个重要指标。标准操作流程文件中需要包括DNA/RNA样本准备、 片段化、建库、样本分子标签（barcode）、样品混合、上机测序相关的所有标 准操作流程指导。在此基础上，所有独立的实验步骤和后续的操作才能够一一被 追溯。 标准操作流程文件需要包括NGS实验过程中所有相关的方法、试剂、仪器、 软件、软件版本等，此外，还应对质控标准进行详细描述，包括详细的质控参数、 接受域和否定域。 例如目标区段捕获测序实验，需要描述捕获区段的基因组信息（包括目标区 域基因组位置、所包括的基因等）、捕获富集的具体方法及流程、包含不同类型 临床样本（血液、FFPE）处理方法的SOP等。 NGS实验操作流程验证 实验室必须对实验操作流程进行验证，并且当流程有修订的时候，必须要对整个 实验操作过程进行重新确认，以检验修订后的流程是否能够符合要求。重新验证 的程度和范围视修订的程度和范围而定。 所有实验室自己研发的分子诊断或临床检测项目，在进行临床应用前必须对 NGS每个操作流程的性能表现进行一个内部的验证。NGS实验是一个复杂的工 作流程，它由很多独立步骤组合而成。每步流程都需要分别优化到一个最佳经验 值，以此来综合决定最佳的实验操作条件及各参数的设置。 在内部验证中需要考虑的必要因素包括：实验的敏感性和特异性、准确性、 精确性以及检测能力的上限和下限（动态范围）。对于任何一个分子实验，对于 不同的样本类型（血液、唾液、组织等）都需要独立的进行一个验证。 考虑到NGS技术并不能够完全的检测到所有理论上的变异情况，因此我们 需要结合“其它检测方法（Sanger、芯片）”和“特定分析物（positivecontrols）