组织RT-PCR注意事项.docVIP

抽提RNA都是为了得到其mRNA，而mRNA和组织的状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选择用液氮保存组织。而且去的时候要尽可能的新鲜，动作要快，取后立即放入液氮罐中。2.提取RNA前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止rna的降解。研磨要充分，使组织块变小。3.加入trizol后要充分吹打开，目的是使组织中的核蛋白体，多糖等与rna分离。4.其次是注意外源性的rna酶污染，操作全过程要戴口罩，手套。操作速度要快，冰上进行。 我做过大鼠下丘脑组织的RT-PCR，在动物房将组织取好先放在RNa－free的EP管中，放在冰盒内，然后再转移到实验室的－70°冰箱内，在抽RNA的时候，脑组织最好要氯仿抽提两次，这个是我在别的地方看到的，但是真的很好用，可以改善RNA抽提的质量。 用生理盐水或PBS冲洗掉血液，分切成50-100mg大小的组织块，早点把提RNA的试剂盒买过来就可以根据说明书加入变性液中（ep管内），－80储存，到时候拿出来组织就很容易撵碎了。如果试剂盒没到，那就直接放在EP管中，提RNA的时候再拿出来再加也可以。就是组织可能会不容易撵碎一些。 我觉得你可以用高压过的EDPC处理的水进行清洗（2－3次），后迅速切成合适的大小的组织（具体大小与RNA提取方法相关，我用的是TRNZOL法，一般取50－100mg，）于EP管中，直接放到－80度冰箱，不需要液体浸泡！到时直接取出提取RNA即可！建议你的剪刀、镊子等物品最好DEPC处理过！1.组织块若没有很多血液，可直接冻存；2.若有较多血液，可用生理盐水冲洗；3.我以前取小肠组织时，先剪开自来水冲洗，再生理盐水冲洗；4.一般1cm左右就可以，根据标本将来的用途。5.直接原组织冻存。 本实验室做过人子宫内膜FGF基因的克隆，方法是从子宫肌瘤切除的人子宫中撕下新鲜内膜组织，冻存与液氮总备用，实验前在液氮中充分研磨后提取总RNA。因为我们的目的是PCR出目的基因，因此并不要求材料100％的纯净，只要引物正确，反应条件合适一般能克隆出目的基因。 例如：从猪肝脏中提取总RNA（本人实验经验）：采用Trizol试剂从新鲜猪肝脏组织中提取总RNA。将液氮冻存的新鲜猪肝脏组织约50mg放入EP管中，用研磨杵迅速研磨，然后加入1mL Trizol试剂室温裂解5min。然后10000r/min，离心1min，将上清液转移到另一新的EP管中,加入200μL氯仿轻轻混匀，室温静置3min。4℃，12000r/min，离心10min，转移上层水相至另一新的EP管中，加入0.5mL异丙醇混匀，室温静置5min。4℃，12000r/min，离心10min，可以看到白色的RNA沉淀贴于EP管底部，弃上清后用75%的乙醇洗涤，真空干燥后用100μLDEPC处理过的ddH2O溶解RNA沉淀。含有RNA的溶解液立即反转录，剩余部分零下70℃冻存。另外我用过RNA提取试剂盒效果也很好，方便，快速，纯度较高 组织匀浆器械：DEPC水处理的匀浆器，一次性换药包，一次性刀片，DEPC水处理枪头，电动匀浆器1.??新鲜或冰冻组织用蒸馏水冲洗除去表面污物切下1mm(3)组织块2.??将组织放入1。5ml的试管底，试管配有研棒3.??加入1mlTrizol4.??插入研棒研磨碎组织块，旋转研棒将组织挤压在使馆壁上，10次左右（电动1－2次）5.??因标本已匀浆话，将匀浆管至于4度冰桶中提取组织RNA提取RNA提取组织RNA的准备事项1。准备DEPC泡的枪头，以及DEPC泡的匀浆器2。用DEPC配制的1*PBS清洗组织3。准备DEPC水配制的75%的酒精，泡制手术器械。带者酒精在火上燎一下。4。器械：离心管2支，吸管4个，酒精灯，打火机，记号笔，200ul,1000UL枪，DEPC泡过的枪头EP管，紫外照过的手套。滤纸，DEPC纯水（750ml无水乙醇＋150mlDEPC水,剧烈振荡，使劲的摇晃，直至混匀），氯仿，75％酒精，异丙醇，Trizol，预冷的离心机（两种），EP管架（洗液擦洗）,手套，灭菌剪刀，镊子（2个），冰桶，冰块，高灵敏度称量仪1.??将组织取出后用眼科剪剪成1mm3左右的小块2.??组织样品按50－100mg/mlTrizol加入Trizol(组织体积不能超过Trizol体积的10％，否则匀浆效果不好，（此时可预冷另一个离心机），研磨10次左右（剩余的组织至于冰桶中，最后存于液氮中3.??4度，12000g离心去除不溶物(匀浆得时候最好将匀浆器放置在冰水中以免发热)4.??带双层手套，混合好的样品全部移置到0.1ml的EP管中，室温15－30度静置5分钟5.??加入0.2ml氯仿/1mlTrizol,盖好EP管，剧烈振荡（上下颠