第05章蛋白质理化性质、提取纯化与结构分析测定.pptVIP

第五章 蛋白质提取纯化、理化性质分析与结构测定 第一节 蛋白质理化性质与分析方法 * 本章主要内容： 1.蛋白质理化性质与分析方法； 2.蛋白质提取、纯化与鉴定的一般步骤； 3.重组蛋白提取、纯化与鉴定的注意事项； 4.蛋白质技术； 5.蛋白质结构测定。 一、蛋白质的两性解离和等电点 二、蛋白质的呈色反应 三、蛋白质的紫外吸收 四、蛋白质的分子量 五、蛋白质的胶体性质 六、蛋白质的沉淀 七、蛋白质的变性与复性 当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为“O”，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点(isoelectric point, pI)。由于各种蛋白质所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。 蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。 蛋白质分子所带电荷的性质决定了它在电场中移动的方向。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。 人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所以在体液中以负离子形式存在。 一、蛋白质的两性解离和等电点 二、蛋白质的呈色反应 (一)茚三酮反应(Ninhydrin Reaction) α-氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色反应。蛋白质是由许多α-氨基酸组成的，故也呈此颜色反应。 (二)双缩脲反应(Biuret Reaction) 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称为双缩脲反应。凡分子中含有两个以上－CO－NH－键的化合物，都呈此反应。 (三)米伦反应(Millon Reaction) 蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀。 此外，蛋白质溶液还可与酚试剂、乙醛酸试剂、浓硝酸等发生颜色反应。 三、蛋白质的紫外吸收 因为蛋白质中含有Tyr、Phe、Trp等芳香氨基酸，其紫外吸收最大峰的波长为280nm。而且光吸收值（OD值）与蛋白质的浓度程正相关。 测定蛋白质浓度的方法：标准曲线法和经验公式法。 标准曲线法: 经验公式法： 蛋白质浓度（mg/ml）= 1.45×OD280-0.74×OD260 注意：在使用该公式时，OD280 应在0.1~0.7之间，所测值才 比较准确。 四、蛋白质的分子量 蛋白质分子大小通常用道尔顿（Dalton，Da）或千道尔顿（kDa）表示，一般在6×103~106之间。 测定蛋白质的分子量有许多方法，常用的有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）、凝胶过滤法等。这些方法的误差为5%~10%。 Dalton: A unit of mass very nearly equal to that of a hydrogen atom. Named after John Dalton (1766–1844), who developed the atomic theory of matter. SDS测定蛋白质分子量 蛋白质洗脱体积与分子量的关系 分子筛层析示意图 凝胶过滤法： 又称分子筛层析法 将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后根据标准曲线计算其分子量。 五、蛋白质的胶体性质 根据溶质在溶剂中的颗粒大小（分散程度），可以把分散系统分为3类： 分散相质点小于1nm的为真溶液，大于100nm的为悬浊液，介于l～100nm的为胶体溶液。 分散相质点在胶体系统中保持稳定，需具备3个条件： 1）分散相质点大小在l~100nm范围内，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中不断作布朗运动（Brown movement）； 2）分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀； 3）分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层（hydration mantle），质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。 六、蛋白质的沉淀 蛋白质分子凝聚并从溶液中析出的现象，称为蛋白质沉淀(precipitation)。 变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有