RNA提取及PCR相关技术.pptVIP

RT-PCR 逆转录步骤 二、PCR扩增（示例） cDNA第一链 2 ul 10×PCR buffer(K+) 5 ul 25mM MgCl2 3 ul (1.5 mM) 10mM dNTPs 1 ul (各200 uM) 50μM引物 正向/ 反向 各0.5 ul (0.1~0.5 uM) Taq 酶 0.5 ul (1~5U) 双蒸水 38.5 ul 总反应体积： 50 ul PCR mix包含：buffer（Mg2+） dNTPs Taq酶 RT-PCR 逆转录步骤 PCR反应条件 95 ℃ 2 min 95 ℃ 30 sec 40-65 ℃ 10-120 sec 22-35cycle 72 ℃ 60-120 sec 72 ℃ 10min 12 ℃ ∞ 退火温度：引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度Tm低5℃左右。两条引物的退火温度相差不应超过4-6℃。 特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温度提高2-5℃）；减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，只会增加非特异性引物杂交的可能性。 注意事项 （1）每次PCR设立对照组和阴性对照组。 （2）科学做法是将内参引物加入目的基因的PCR扩增 反应体系中，同时扩增作为对照。 （3）将反应体系中的相同试剂预先混合，再分装成各 反应管。 （4）设定合适的循环次数，PCR不能进入平台期。 （5）在一定范围内调整Mg2+浓度、引物浓度、退火温 度，消除非特异性扩增。 结果鉴定 琼脂糖凝胶电泳分析结果： 2％琼脂糖凝胶，取4-8 ul产物上样，60V电泳40min， 紫外灯下观察结果。 采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描，测定灰度值。 注意：灰度扫描时，选择合适的胶空白区域作为扣除的 背景灰度值。 基因表达的差异分析－相对定量 各反应体系以内参基因为参照，计算待测基因产物 与其灰度比值，作为待测基因的表达值。即 待测基因产物电泳带灰度值 内参基因产物电泳带灰度值 双标准曲线法： 待测样本基因相对表达量 参照样本基因相对表达量 ＝ 待测基因 相对表达量 结果示例 结果示例 荧光定量PCR (Real-time PCR, qPCR) PCR + 荧光探针/ 荧光染料 ①应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达 研究、病原体检测及PCR条件的优化等。 ②可定量原理：经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而 达到定量目的。 ③无须凝胶电泳：只须反应管内直接检测。 ④减少污染环节：全封闭反应管。 ⑤结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。 Log [DNA] 循环数 线性增长期Linear 平台期Plateau y = x(1+e)n 指数增长期Geometric Real-time PCR 相同模板进行96次扩增的扩增曲线图 起始拷贝数越高，Ct值越小；起始拷贝数越低， Ct值越大 与DNA结合时发光 游离时不发光 一种DNA小沟结合染料 1．SYBR? Green I 荧光染料 在PCR过程中染料与DNA结合发光 聚合完成 聚合开始 SYBR? Green I 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 染料一结合，就产生荧光信号 信号强度与DNA分子总数目成正比 数量关系 一条探针，两条引物 引物位于探针的两边 一条探针，两个基团 前边是报告基团，后边是淬灭基团 ? 3 5 R Q 3 3 5 5 3 5 5 ２．TaqMan探针/水解探针 每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 数量关系 5’ TaqMan 探针 上游引物 3’ 3’ 5’ 下游引物 R Q 3’ 5’ 3’ 5’ Q R Real-time PCR反应体系 cDNA第一链 2 ul 10μM引物 正向/ 反