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TECHNICAL MANUAL UCATM CRISPR/Cas9 快速构建及活性检测试剂盒 （荧光素酶版） 一、 产品介绍 1. 简介 UCATM 系列产品是一种新的CRISPR/Cas9 活性检测方法。本产品具有以 下优点：  无物种限制：不需要相应物种的细胞系。本试剂盒使用的是真核表达系统， 可直接用于所有哺乳动物及相关细胞系的sgRNA 活性检测和基因打靶。对 于其它物种，可将相应的sgRNA 和靶序列片段克隆到试剂盒中的载体上， 从而进行活性的鉴定。  高通量：可选用96 、384 孔板进行检测。  适用性广：可应用于CRISPR/Cas9 、TALEN 、ZFN 等多种核酸酶活性的检 测。  高灵敏度 ：检测灵敏度高于传统的基于 mismatch-specific DNA endonuclease 检测方法。  简便性：与基于mismatch-specific DNA endonuclease 、测序等检测方法 相比，省略了基因组提取、PCR、酶切、电泳、测序等步骤。荧光素酶表 达于培养基，荧光素酶的检测无需裂解细胞，直接使用培养板中的培养基进 行检测即可。 2. 应用 UCATM 系列产品用于构建、鉴定和筛选sgRNA ，选取活性最高的sgRNA 用于后续的基因编辑实验，如：通过受精卵注射制备模式动物、细胞系基因打靶 等，从而保证研究工作的成功率，将失败的风险降至最低。 3. precut pUCA(Luc)质粒 如图1 所示，pUCA(Luc)是sgRNA 的报告基因质粒，其中的Luc (Luciferase) 基因内部含有终止密码子和CRISPR/Cas9 的靶位点序列。终止密码子和靶位点 序列两端为Luciferase 的互补重复序列(“ er ”) 。终止密码子导致Luc 的翻译提前 终止，表达无功能的荧光素酶（”Lucif er”）。核酸酶对靶位点的切割会引发基于 SSA (Single Strand Annealing) 的DNA 修复机制，互补序列（“er ”）通过重组 而形成了完整的荧光素酶编码序列，从而表达有功能的荧光素酶。荧光素酶的活 性与CRISPR/Cas9 的活性成正相关。 precut pUCA(Luc)是平末端线性化的pUCA(Luc)质粒 （图2）。平末端PCR 产物可以不经过酶切而直接连入载体中。 克隆位点两端含有测序引物M13F 和M13R，外侧为截短的荧光素酶编码序 列“Lucif er”和“er ase”。 此载体中含有红色荧光蛋白dsRed-E2 表达元件，可用于：（1）通过观察红 色荧光，确定转染实验成功；（2）利用荧光定量仪对每孔的dsRed 进行定量， 作为每孔的内参，可用于校准由转染效率、种板密度差异等因素造成的孔间误差。 图1. 利用SSA 机制检测CRISPR/Cas9 活性原理示意图。 图2. precut pUCA(Luc)质粒图谱 4. precut pCS(puro)质粒 （可选） precut pCS(puro)质粒 （图3）为线性化的pCS(puro)质粒，表达sgRNA 和 Cas9 蛋白质。 线性化位点的两端为不同的粘性末端，sgRNA oligo 退火后连入此载体，即 可通过U6 启动子表达靶向目的基因的sgRNA 。 此载体中已有Cas9 表达元件，因此只需一个质粒即可完成CRISPR/Cas9 工作系统。 质粒骨架中包含嘌呤霉素抗性基因，可用于稳定细胞系或基因敲除细胞系的 制备。 图3. precut pCS(puro)质粒图谱。 5. pCS(puro)-Positive 质粒 此质粒作为活性检测的阳性对照，表达一段已验证过具有活性的 positive-sgRNA 。precut pUCA(Luc)质粒的 “Lucif er”和“er ase”中间已含有 positive-sgRNA 的靶位点序列，且克隆为环状质粒后仍然存在。因此在转染实 验中，转染pUCA(Luc