RT-PCR实验心得---细节.pdfVIP

RT-PCR 实验心得 ■ 提取 RNA(我做细胞的) 1.取中号培养瓶(100ml 培养瓶 注:此时细胞汇合度≥80%),用 PBS 洗细胞两次， 弃尽 PBS 后加 2mlTRIzol （量大无防！）,细胞用用吹打管吹至液体澄清且无 细胞团块转至 2 个 1.5EP 管中. 2.颠倒摇晃 10 下，室温 5 分钟. 3.在 2 个 EP 管中各加入 0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管 15 秒并 将其在 30°C 下孵育 2—3 分钟。 4.在 2—8°C 下用不超过 12,000×g 的离心力高速冷冻离心 15 分钟。离心后混合 物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。 5.用移液枪分别转上层水相（约 500-600μl ）于另二个 1.5mlEP 管中,加等体积异 丙醇（约 500-600μl ），混匀室温 10 分钟来沉淀 RNA→在 2—8°C 下以不超过 12,000×g 的离心力高速冷冻离心 10 分钟。注:移液枪的枪头不宜伸入液面太 深, 以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA 沉淀形成一胶状片状 沉淀附着于试管壁和管底。 6.舍弃上清,用 75% 的乙醇(用 DEPC 水处理的,临时十分钟配,预冷保存于 4°C 或 -20°C) 1 ml 来洗涤 RNA 沉淀→在 2—8°C 下以不超过 7,500 ×g 的离心力高速 冷冻离心 5 分钟。;离心前注意放管的方向, 注:旋涡振荡混合样品;RNA 在 75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可 保存一年! 7 弃上清，置于卫生纸上，自然晾干（不能完全干燥）,用 20-50μl DEPC 水溶解。 (建议装于 0.6 的EP 管中.) 8 紫外光度检测 注:该步后,可保存于-70 ℃超低温冰箱,或算好计量建立体系立即用于逆转录. ■ RT 反应体系注意事项 1.RT试剂盒中试剂解冻后, 摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在 冰上操作. 2 PCR 仪预热到 50°C,在放 PCR 管于 PCR 仪上(之前在冰上!)开始逆转录. 3 反应体系准备:比原体系大 10%;建立25ul 的反应体系;先按总反应体系混合总 体体系反应物,在分装于 PCR 管中(分装前宜离心!),再分别加 RNA和引物/内 参; 4 RNA的量宜大2ug/reaction! 5 要有要有逆转录(50℃,30min)和初始热活化(95℃, 15 min); ■Reaction components for one-step RT-PCR using Q-Solution （我的一步法） Component Volume/reaction Final concentration Master mix RNase-free water – (provided) 5x QIAGEN OneStep 10.0/5 μl 1x RT-PCR Buffer* dNTP Mix (containing 10 2.0/1 μl 400 μM of each dNTP mM each dNTP) 5x Q-Solution 10.0/5 μl 1x Primer A 0.6 μM† Primer B 0.6 μM† QIAGEN OneStep x 2.0 /1μl – RT-PCR Enzyme Mix Template RNA 0.5/1 pg – 1/2 μg/reaction Total volume 50.0/25ul _ 注:引物/ 内参在反应体系中的浓度为20μM. 反应体系要搞清! ■PCR 反应体系 step