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生物·解题方略 PCR引物设计及试题分析 □ 张卓鹏 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技 引物确定以后，可以对引物进行必要的 术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内 修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序 复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效 列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增 地解决了因为样品中DNA含量太低而难于对 的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任 样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于 何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因 里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第 克隆和DNA序列测定等各方面。近年来，有 3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩 关PCR 引物的考查成为高考生物“基因工程” 增的特异性与效率。 中的一个亮点，对学生思维的灵活性和临场 综上所述，可以归纳出十条PCR 引物的 答题的机敏性提出了更高的要求。下面拟通 设计原则： 过介绍PCR 引物设计的多个原则，望能拓宽 ① 引物应用核酸系列保守区内设计，并 学生解题的思路，迁移知识，灵活解题。 具有特异性。 ②扩增产物的单链不能形成二级结构。 一、PCR 引物的设计原则 ③引物长度一般在15~30个碱基对之间。 PCR 引物设计的目的是为了找到一对合 ④ （G+C）含量在40%~60%之间。 适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 ⑤碱基要随机分布。 DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 的特异性与成功与否。 ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 要设计引物，首先要找到DNA序列的保 ⑧ 引物5′端可以修饰。 守区。同时应预测将要扩增片段的单链是否 ⑨ 引物3′端不可修饰。 形成二级结构（DNA的二级结构是指两条脱 ⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。 氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋 结构）。如这个区域单链能形成二级结构，就 例1 下图1为采用PCR 技术从 97 要避开它。如这一段不能形成二级结构，那 DNA分子中获取目的基因并扩增的部分过 就可以在这一区域设计引物。 程。下图2为获得抗虫棉的技术流程，其中卡 然后在这一保守区域里设计一对引物。 那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有 一般引物长度为15~30个碱基对，扩增片段 含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素 长度为100~600个碱基对。 培养基上生长。请据图回答： 引物序列中（G+C）含量一般为40%~ 60%。而且四种碱基的分布最好是随机的。不 要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则引物的设计 就不合理，应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一 对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 图1 生物·解题方略 图2