细胞生物学-3细胞生物学研究方法-01.pptVIP

在显微镜下， 用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术属显微操作技术。显微操作仪是在显微镜下对细胞进行显微操作的装置，可用于细胞核移植、基因注入、染色体微切和胚胎切割等手术 绵羊B 乳腺细胞核 异核卵 融合卵 绵羊C子宫 多莉 植入 植入 生产 克隆多莉羊示意图 取出 未受精卵 去核 电激 体外胚胎发育 绵羊A 动物体细胞克隆意义证明了动物的体细胞具有全能性， 而且有巨大的应用前景。例如结合转基因技术生产药物。现在很多药物如胰岛素、生长激素、表皮生长因子等都是动物细胞体内正常的代谢物，某些病人由于产生这些物质的功能发生缺陷，导致了相应疾病的发生，目前的治疗方法就是给这些病人注射这类药物。由于这类药物本身是来自动物的某些脏器，制备这种药物就需要大量的动物提供脏器，因此成本就很高，如果通过转基因技术把相应的基因转入到哺乳动物，让动物的乳汁生产具有疗效的蛋白质就会降低成本，再结合动物体细胞克隆技术，将这种转基因动物大量无性繁殖克隆，就可以大大提高产量，大幅度降低成本，同时也保证了所转基因的稳定。该项技术也可以生产供动物本身和人类器官移植的动物， 解决器官捐赠长期缺乏的问题。另外，动物体细胞克隆技术在基因结构和功能、基因治疗、遗传病及人类衰老等的研究方面都具有巨大的潜力 用转基因绵羊生产重要的医用蛋白质 肌动蛋白纤维的负染电镜照片 家蚕细小病毒负染色电镜照片 金属投影法 特点：采用金属喷镀仪将某些重金属物质加热到熔点以上，形成极细小的颗粒投射到样品上，产生电子反差。 应用：主要用于微颗粒状生物样品，如细菌、病毒、原生动物、孢子、分离的 微纤丝、蛋白质分子、核酸分子以及其它各种非生物的微粒和粉末材料。 缺点：由于受到投影金属材料颗粒度的限制，其分辨率不是很高，尤其是对于病毒等极小的颗粒样品，现已被负染色技术代替。 优点：可以测量颗粒的大小和高度；增大颗粒尺寸，以改善电镜下的可见性，如核酸分子的观察；增加扫描电镜样品表面导电性；时制备复型、冷冻蚀刻复型等技术的基础。　 取材— 前固定(4%戊二醛)PBS洗残余的戊后固定(4℃, 锇酸) 脱水(乙醇或丙酮) 包埋(环氧树脂) 修片 切片(600埃，银色) 染色(醋酸铀与铅盐) 观察 大鼠骨髓干细胞的超薄切片 原理：标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构 冰冻蚀刻电镜照片 用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。 “如果你能脚踏实地从事研究并如实报告观察结果，同时保持健康长寿，那么，你有可能获诺贝尔奖。” 1951年芭芭拉.麦克林托克于冷泉港的学术研讨会上，以“染色体结构与基因表达”为题，公开其六年辛勤努力的研究成果－跳跃基因学说。 1956年芭芭拉再次于冷泉港的学术研讨会上，阐述她的跳跃基因学说与相关的机制， 1983年，获得诺贝尔生理医学奖的肯定 X-射线衍射(X-ray diffraction) X-衍射技术并不涉及显微镜， 但是能够根据X-射线通过结晶样品形成的衍射样式成像。这一技术可用于在原子分辨的水平上推测分子的结构。实际上X-射线衍射技术是目前在原子水平上分析蛋白质、核酸和其他生物分子的惟一方法。Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型的主要依据之一就是根据Franklin对DNA晶体衍射的结果 富兰克琳-与诺贝尔奖擦肩而过的女科学家 ???? 　　英