实验二 免疫球蛋白粗提.pptVIP

实验一、免疫球蛋白的粗提 实验目的： 学习免疫球蛋白的粗提方法 实践IgG分离纯化过程 了解分离纯化抗体的原理 多克隆抗体血清含有多种蛋白质组分，不适用于实验室分析、检测应用。 根据实验目的不同，可按照不同的方法对有效的抗体成分进行分离、纯化。 盐析法原理 水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础， 在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。 蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33% （NH4）2SO4 为沉淀IgG的最适饱和度。 盐析法沉淀抗原的机理 材料与试剂配制 1．动物血清 2．硫酸铵饱和溶液 硫酸铵 800g~850g H2O 1 000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。 注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过， 加热蒸发H2S即可。 3．0.01Mol/L pH7.4 PBS液 A液：0.10Mol/L NaH2PO4液 NaH2PO4·2H2O 15.60g 加H2O至 1 000.ml B液：0.10Mol/L Na2HPO4液 Na2HPO4·12H2O 35.80g 加H2O至 1 000ml 取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。 4．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。 5．透析袋（或玻璃纸）。 实验步骤 1.免疫血清 0.5 mL 　　　　↓加 0.5mL 生理盐水/PBS 2. 逐滴加入饱和（NH4）2SO4 1 mL（此时为50%饱和度） 4℃，静置 20 min 3. ↓3000 r/min 离心 20 min 　　　取沉淀溶于 2 mL 生理盐水/PBS中 　　　 ↓ 4.逐滴加入饱和（NH4）2SO4 1 mL（此时为33%饱和度） 4℃，静置 20 min ↓3000 r/min 离心 20 min 重复步骤3～5，2次 7. 取沉淀溶于0.5 mL 生理盐水中 　 ↓ 　　 装入透析袋 透析除盐，在常水中透析过夜， 再在生理盐水/PBS中于4℃透析24h，中间换液数次。 取出放于聚乙二醇浓缩10min，取出打开将提取物放于EP管中，-20摄氏度保纯备用。 注意事项 （1）.盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避免产生气泡。 （2）.注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。 作业与思考题： 1，常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法主要有那几种？各自得到的纯度如何？ 2，五类免疫球蛋白分离纯化的方法皆相同吗？ 3，分离纯化IgG时，为什么硫酸铵的饱和度先调至50%，然后调至33%？加入硫酸铵溶液时，为什么要一滴滴地加？ IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。 ⑴ 区带电泳 ⑵ 琼脂双相双扩散鉴定 ⑶ 免疫电泳鉴定 ⑷ 圆盘电泳鉴定 * *