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第三章 蛋白质组研究方法 Chapter 3 Research Methods in Proteomics 主 要 内 容 蛋白质研究方法的概述 大规模的蛋白质分离技术 高通量蛋白质鉴定技术 第一节 概述 一、蛋白质组的研究远比基因组的研究要复杂的多 蛋白质的数目远大于基因的数目：基因的拼接和翻译后修饰 蛋白质是动态/基因是相对静态的 氨基酸种类远多于核苷酸种类 技术手段上：基因研究有PCR、DNA自动测序技术、DNA微阵列技术等；蛋白质没有相匹配的技术 二、蛋白质研究技术的发展 双向电泳技术：1975年，O’Farrel建立的；是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，一般能分离1000 – 3000个蛋白质点 图像分析与大规模数据处理软件 两种软电离质谱技术－基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）与电喷雾电离质谱（electro-spray ionization mass spectrometry, ESI-MS）：可精确测定生物大分子的相对分子质量及多肽序列，使得微量快速的蛋白质鉴定得以实现 双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术、质谱技术蛋白质组研究的三大基本支撑技术。 三、蛋白质组研究步骤 2-D电泳 高效柱层析分离蛋白质 氨基酸组成分析、C-端或N-端氨基酸序列分析及MS鉴定所分离的蛋白质 生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析 四、新的蛋白质组研究技术 定量蛋白质组学研究：同位素编码亲和标签技术（isotope-coded affinity tags, ICAT）和双色荧光技术等 蛋白质相互作用：酵母双杂交技术、蛋白质复合物免疫分离与质谱鉴定技术； 蛋白质分离于鉴定：多维色谱－质谱联用技术 翻译后修饰：蛋白质图谱展示与检测技术 蛋白质表达：蛋白质芯片技术 第二节 大规模的蛋白质分离技术 蛋白质组学的目的：实现对一个基因组所编码的全部蛋白质及其相互作用的研究 首要问题：蛋白质的有效分离 理想的蛋白质分离方法：超高分辨率；可针对不同类型的蛋白质 一、二维凝胶电泳 1. 2-DE的介绍：是目前唯一能够将数千种蛋白同时分离与展示的技术 1.1 在2-DE中，蛋白质首先根据等电点的不同，在一向等电聚焦电泳中分离，接着被转移到二向SDS-聚丙稀酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离 1.2 固相化pH梯度（immobilized pH gradient, IPG）等电聚焦电泳技术；微量鉴定技术以及质谱技术灵敏度的提高 1.3 不足：膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离与检测；重复性以及规模化和自动化的问题等 1.4 改进：2-DE样品的前处理；2-DE后的蛋白点的检测研究等 第一向进行等电聚焦（isoelectric focusing ,IEF）,由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH梯度介质区域内。目前常使用预制胶条（IPG）用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的IPG胶条在含有SDS的缓冲液中平衡 第二向是将在IPG胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到SDS凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量大小与第一向相垂直的分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息 2.低丰度蛋白、膜蛋白的检测与样品预分离 2.1 低丰度蛋白 大部分的蛋白质是低丰度的蛋白质，而低丰度的蛋白质往往是执行重要生物功能的蛋白质 密码子偏性（ codon bias）:指生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的非均衡使用现象。 密码子偏性系数（ codon bias index）: CBI小于0.2的基因编码的蛋白质为低丰度蛋白质。 酵母中2500个编码基因的CBI小于0.1。 一步法（one-extract-one-gel）：一步提取的细胞总蛋白在一块胶上进行电泳分离；高丰度蛋白 加大上样量，但有限制 窄范围的IPG胶条（2-3个pH单位）、非常窄范围的IPG胶条（约1个pH单位）：可以增加电泳胶的分辨率，加大样品的负载量，但存在超出pH范围的蛋白 去除高丰度的蛋白质 蛋白质的检出限预染色方法、起始加样量的关系 2. 2 膜蛋白 膜蛋白是一些疏水性的蛋白质，在常规2-DE的提取液中的溶解度低，另外因聚焦而产生浓缩、聚集，从而