病理组织学常用制备技术.docxVIP

一、组织的固定（一）固定的概念应用各种方法使病理标本尽量保持其离体前状态的过程称为固定（fixation）。病理标本（样本）离体后，由于微环境的变化将发生自溶和（或）腐败，使其结构破坏。固定的目的和机制是：①使蛋白质凝固，终止或减少分解酶的作用，防止自溶，保存组织、细胞的离体前结构状态，包括保存组织或细胞的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。②保存组织、细胞内的蛋白质、脂肪、糖原、某些维生素及病理性蓄积物，维持病变的特异性特征。③使上述物质转为不溶解状态，防止和尽量减少制片过程中人为的溶解和丢失。④起助染作用。固定方法有：①物理学方法，如低温冷冻，干冰（dry ice，即固态无水碳酸）冰冻真空脱水，石蜡渗入法。②化学方法，采用各种化学溶液作固定液，使组织细胞进入固定状态。这是国内最常用的方法。固定应在标本离体后尽快进行，小标本可在取材后直接放入固定液内，大标本应在手术结束前或结束后迅速放入固定液内。固定液与标本的比例不得少于标本体积得5倍。有特殊要求者应事先选定相应得固定液，如欲查糖原，应选择无水乙醇作固定液等。固定得时间应适当，微小标本（如胃粘膜等）2～4h即可，大标本应置放12～24h，但亦不要过久，以免影响抗原性，造成免疫组化操作中得困难。（二）常用固定液及其配制固定液分单纯固定液和混合固定液。1.甲醛（formaldehyde）是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。2.乙醇无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。3.中性甲醛液（混合固定液）甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。4.AF液（混合固定液）95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。二、常规石蜡切片操作（一）组织洗涤经过固定的组织一般都要洗涤（washing），其目的是清除组织内外残留的固定剂，以免影响脱水等后续过程；防止有些固定剂在组织中发生沉淀或结晶而影响观察。洗涤时最好是从容器的底部入水，再从容器上面缓慢流出，这样2h即可，若为陈旧标本则需24h。（二）组织脱水1.概念为保证石蜡有可能进入组织内部，采用适当方法，将已固定和水洗过的组织中的水分彻底驱除的过程称为脱水（dehydration）。脱水剂必须是与水在任何比例均能混合的液体。最常用的脱水剂为乙醇，其它尚有正丁醇和二氧已环以及丙酮等。2.浓度与时间脱水用的乙醇浓度一般从70％~75％开始，然后依次80％→95％→100％，即由低浓度逐步到高浓度。脱水的时间与组织大小、厚薄有很大关系、组织厚大，脱水时间要长些；而小薄的组织脱水时间相对的可以短些。组织脱水时间在低浓度乙醇中可以长些（如70％~80％），而在高浓度乙醇中要短些，这是因为高浓度的乙醇渗透力不强，延长脱水时间无益，相反高浓度乙易使组织收缩、变脆，致使以后切片和观察困难。（三）组织透明采用既能与脱水剂（如乙醇）混合，并使之被提去（dealcoholisation），又能作为石蜡溶媒的诱导剂，使石蜡真正渗入组织中的过程称为媒介（intermediary）。由于常用的透明剂（如二甲苯）作用之后，其折射指数与组织蛋白折射指数接近，组织显示出半透明状态，因此，通常又称此过程为透明（clearing）。但并非所有媒介过程均使组织透明。常用的透明剂为二甲苯，它易使组织收缩、变脆，故透明时间不宜长，一般1..5~2h，二节（即换2次，下同），最好是肉眼观察，见组织呈棕黄*色或暗红色透明状（象琥珀样）即可。（四）组织浸蜡组织经媒介（透明）处理后，置入熔化的石蜡内浸渍，使石蜡分子浸透入组织中的过程称浸蜡或石蜡渗透（infiltrating）。渗透的过程也可用火棉胶代替石蜡，称为浸胶。但其透明过程应作相应更动。浸蜡一般分2~3节，总共4~24h，浸蜡时间过短，蜡没有完全渗入组织中，组织过软，切片困难；浸蜡时间过长，造成组织硬脆，切片也困难。（五）组织包埋把浸蜡的组织包在