实验四、定磷法测定核酸的含量.pptVIP

实验四、定磷法测定核酸含量 核酸定量测定常见的方法 1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。 一、实验原理 首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为： (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 ? MoO3（钼蓝） 二、试剂与材料 1、标准磷溶液： K2HPO4（105℃ 烘干至恒重）0.2195g+H2O 定容至50ml(含磷量1mg/ml),冰箱中保存备用。 临用前稀释50倍，成为含磷量为20ug/ml。 2、定磷试剂： 先配制3M硫酸、2.5%钼酸铵、10%抗坏血酸，可在冰箱中保存。 临用时按体积比及顺序配制： 水：3M硫酸：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=2 ：1：1：1 注意：硫酸加入水中要小心，应慢慢加入 3、沉淀剂： 1g钼酸铵+14ml 70%过氯酸+386ml水 4、5M硫酸5、30%过氧化氢6、离心机7、凯氏烧瓶8、烘箱9、分光光度计10、核酸样品液：酵母RNA1-10 mg/ml11、愠温水浴 实验步骤 1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线； 3. 测定回收率和样品总磷量。 1. 样品消化（每两组或三组做一份） 吸取核酸样品液1ml于凯氏烧瓶中，另吸取蒸馏水1ml做空白试验。各加入2 ml 5M硫酸。置于140-160℃烘箱内消化2-4h，待溶液呈黄褐色后，取出冷却，加入1-2滴30%过氧化氢，继续消化，到溶液透明为止。取出冷却后加入1ml 蒸馏水，于沸水浴中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。然后将消化液用蒸馏水转移至100ml容量瓶中定容到刻度。 2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份） 每人取18支试管，按照下表平行操作： 3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行） 数据处理 关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管作为空白。 以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。 操作注意事项 1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。 思考题 1. 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。 3. 定磷法操作注意哪些操作环节? 实验结束 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿中。 将实验台面擦干净。 * * Vit ? C 定磷法的原理 还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA的含磷量平均为9.9%。 50 50 50 用dH2O定容/mL 沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却 消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却 1 1 1 dH2O/mL 2 2 2 5mol/L H2SO4/mL 混匀 0 0 1 dH2O/