基于激光剥蚀―电感耦合等离子体质谱技术的生物元素成像分析.docVIP

　　基于激光剥蚀―电感耦合等离子体质谱技术的生物元素成像分析 摘要 生物体内的微量元素具有十分重要的生物功能，也与许多疾病密切相关。现代生物医学的研究亟需能在组织、细胞等不同水平上原位分析生物样品中微量元素的分析方法。本研究建立了激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LAICPMS）原位分析生物样品的方法。采用线扫描模式和较小的激光输出能量（1J/cm2），得到了鼠脑切片和金纳米颗粒暴露后单细胞的金属元素成像图。LAICPMS具有空间分辨率高、检出限好、运行成本较低等优势，有望在生物医学研究中得到更广泛的应用，发挥更重要的作用。 中国 8/vie 　　关键词电感耦合等离子体质谱；激光剥蚀；元素成像；单细胞分析；鼠脑切片；金纳米颗粒 　　1引言 　　生物体内的微量元素具有十分重要的生物功能，参与多种生物化学过程[1＼]，如金属离子常作为蛋白质的活性中心，催化和调节生物体内的化学反应[2＼]。微量元素还与一些疾病的发生发展密切相关[3＼]。研究发现，阿尔茨海默病（Alzheimer′sdisease，AD）患者大脑的沉积斑中有高浓度的铜、锌、铁离子[4＼]；金属离子在脑组织微区内的代谢紊乱、氧化应激与AD的形成和损伤关系密切[5＼]。因此，生物样品中微量元素的分析和检测，特别是元素的原位微区分析，无论对于研究微量元素在生物体内的结构、功能和生物效应，还是对于阐明与微量元素相关疾病的发病机理，寻找这些疾病的预防和治疗策略，都具有重要的意义。 　　生物体内微量元素的分析主要使用原子吸收、原子发射、原子荧光、无机质谱等原子光谱/质谱仪器完成。常规方法大都需要使用强酸消化样品，前处理过程冗长而繁琐，一般只能得到元素总量的信息，而无法得到元素在生物样品中的分布信息。如果采用具有空间分辨能力的原位分析方法，如二次离子质谱[6＼]、激光电离飞行时间质谱[7＼]、同步辐射X射线荧光[8＼]、激光烧蚀电感耦合等离子体质谱（Laserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry，LAICPMS）[9＼]等方法，可以实现生物样品中元素的原位、微区分析，得到元素成像图。 　　在上述原位元素分析方法中，LAICPMS由于具有空间分辨率好（约5μm）、分析检出限低（10 　　4g/L级）、仪器商品化程度高、运行成本较低等优点，逐渐成为应用最广泛的元素成像方法[10，11＼]。杨红霞等[12＼]利用LAICPMS原位分析了印度芥菜中的7种元素，得到了植物茎中的元素分布图；冯流星等[13＼]将同位素稀释法应用于LAICPMS的定量分析，建立了生物切片中Fe元素的原位定量分析方法。本实验详细描述LAICPMS元素成像的步骤和方法，并将建立的方法应用于鼠脑切片和单个细胞的元素成像分析。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　NS调谐用标准物质（SRM612），30nm金纳米颗粒（RM8012）购自美国国家标准与技术研究院（NIST）；细胞培养基、小牛血清、PBS、胰酶、青霉素、链霉素均购自美国赛默飞世尔科技有限公司。 　　2.2样品前处理 　　3月龄正常小鼠麻醉后，用生理盐水快速灌注15min，再断头取脑组织。将脑组织快速冷冻，制成30μm厚的冠状切片，置于干燥器中备用。 　　小鼠巨噬?胞（RAEM/F12培养基在培养箱中（37℃，5%CO2）培养。NIST金纳米颗粒超声处理后，用纯水稀释至合适的浓度，加入细胞培养液。细胞暴露于0.1mmol/L金纳米颗粒4h后，JP吸出细胞培养液，用PBS反复清洗后，将细胞转移至腔室载玻片，待细胞贴壁后，除去腔室间的隔断，将载玻片置于干燥器中备用。 　　2.3LAICPMS实验 　　激光剥蚀产生的气溶胶由He气载带出样品ZH（池，通过三通与Ar气混合后进入ICPMS分析。ICPMS用NIST612调谐，使U、Th信号最强且得到较低的氧化物产率（UO+/U+）。LAICPMS所用的仪器参数见表1。 　　LA采用线剥蚀模式，激光剥蚀时自动触发ICPMS以时间分辨模式采集质谱数据。所得数据用MicrosoftExcel处理，用IgorPro.（美国etrics公司）软件画出元素成像图。 　　3结果与讨论 　　激光烧蚀系统可以作为ICPMS的固体进样装置，工作时激光束先剥蚀样品表面，产生的固体气溶胶被载气运送至等离子体而完成电离，然后在质谱中得到检测。LAICPMS的准确分析需要尽可能地满足下面3个条件：（1）激光剥蚀产生的气溶胶与固体样品的组成相同；（2）气溶胶可以高效率地传输至质谱；（3）进入质谱的气溶胶可以完全电离[14＼]。在实际分析过程中，上CM（203/5述条件常常很难完全满足，这样会导致“元素分CM）ZH）馏”（不同元素在LAICPMS分析过程