乳酸发酵实验教学.docxVIP

米根霉发酵生产L-乳酸1 前言乳酸是一种天然有机化合物，它广泛地应用在食品、化工、医药品中，是一种重要的原料。乳酸可分为L-乳酸和D-乳酸两种类型，人体不能过多的摄入D-乳酸，过多的摄入会使新陈代谢发生紊乱。L-乳酸的聚合物是一种可降解的、具有良好韧性的新型材料，其原料为可再生资源。因此L-乳酸已近被认为最具发展潜力的材料。目前已经在社会上各个领域得到广泛的应用。目前社会工业上最主要生产的是L-乳酸，而且大都采用米根霉发酵法生产L-乳酸，这种方法具有操作简单、原料便宜、产物纯度高、菌种易于培养等优点。但由于技术不够高使其也有缺点，如生产的周期长、糖的转化效率太低、菌种易于结成团。抑制了工业上的应用，因此必须解决上述问题，才能使米根霉发酵法生产L-乳酸在工业上得到广泛的应用。2 目的本实验的目的主要是认识米根霉发酵法生产L-乳酸的过程，掌握米根霉发酵产L-乳酸的方法，使学生对米根霉发酵法生产L-乳酸有感性的认识，并掌握葡萄糖及乳酸的化学测定方法。3原理葡萄糖进入细胞内后，在细胞液中通过EMP途径被分解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下直接脱氢形成目标产物—L-乳酸，其反应式如下：2C6H12O6→3C3H6O3 + C2H5OH + CO24实验材料4.1 菌种本实验所使用的菌种为米根霉(Rhizopusoryzae)。4.2 使用的主要试剂与仪器实验试剂试剂名称规格葡萄糖分析纯木糖分析纯琼脂粉生化试剂硫酸铵分析纯3,5一二硝基水杨酸分析纯七水合硫酸锌分析纯碳酸钙分析纯钙羧酸分析纯磷酸二氢钾分析纯结晶酚分析纯氯化钠分析纯氢氧化钠分析纯乙二胺四乙酸二钠分析纯无水亚硫酸钠分析纯盐酸分析纯酒石酸钾钠分析纯实验仪器名称SW-CJ-2F型超净工作台SHP-160D型智能低温生化培养箱HYG-B全温度摇瓶柜TU-1810紫外可见分光光度计LDZX-50KBS立体压力蒸汽灭菌器JZC-TSC电子计重天平CP114型电子天平DHG-9101-OS型电热恒温鼓风干燥箱HH-S恒温水浴锅BCD-209KHA型冰箱3L发酵罐5培养基5.1 菌种斜面保藏培养基取新鲜的马铃薯，去皮以后称取200 g切成小块，加入1000 mL水，煮沸20 min以后(能用玻璃棒戳破即可)，用纱布过滤，在滤液中加入20 g琼脂粉和20 g葡萄糖，然后加热融化并补足失水至1000 mL。放置于高压蒸汽灭菌锅中121℃下灭菌15 min后，将其倒入三角瓶中冷却制成斜面培养基。5.2 种子与发酵培养基(g/L)(1) 葡萄糖发酵培养基：葡萄糖80 g/L，(NH4)2SO4 4 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、ZnSO4·7H2O 0.44 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CaCO3 40 g/L，pH值自然，以上培养基皆于121℃灭菌15 min。种子培养基葡萄糖为40 g/L。6检测方法6.1 EDTA法测定发酵液中乳酸的含量（1）溶液的配制 (1) 0.05 mol/L EDTA溶液：准确称取18.612 g的EDTA，加水溶解以后定容至 1000 ml。 (2) 钙指示剂：称取1 g钙羧酸和100 g的氯化钠，使两者充分混合后，保存在棕色瓶中备用。（2）实验方法取l mL发酵液(V1)加入到盛有100 mL蒸馏水的三角瓶中，然后加入10 ml1 mol/L的NaOH溶液与少量钙指示剂，用0.05 mol/L EDTA溶液滴定。溶液由紫红色变为纯蓝色即为滴定终点，消耗EDTA溶液的体积记为V2。（3）结果计算 L-乳酸的含量(g/L)=(90.08×0.1×V1)/V2 V1:滴定到终点时消耗的EDTA溶液体积(ml) V2:X吸取的发酵液体积(通常为1 ml)6.2 DNS法发测定酵液中残糖含量由于单糖含有游离的酮基或醛基，具有还原性，因此单糖属于还原糖。而蔗糖和多糖等，由于不含游离的醛基或酮基，因而他们属于非还原性糖。多糖能够被水解为单糖，此时可以通过测定水解后单糖的含量来测定原来总糖的含量。发酵液中残糖的测定方法主要有菲林试剂法、高效液相色谱法和DNS法。本实验主要采用DNS法来测定发酵液中残糖的含量。（1）溶液的配制 DNS显色剂：准确称取酒石酸钾钠182 g、重蒸馏酚4 g、无水亚硫酸钠3 g、氢氧化钠20 g，3,5－二硝基水杨酸6.3 g，加水溶解以后定溶到1000 ml。将配置好的溶液倒入棕色试剂瓶中保存备用。 1%葡萄糖标准溶液：准确称取100 mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容至1000 ml。（2）标准曲线的绘制取9只试管，编号为1～9。分别量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的1%葡萄糖标准溶液于8只试管中，加入1 ml的蒸馏水，然