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色谱方法学验证 所谓方法验证(validation，又叫认证)就是要证明所开发方法的实用性和可靠性。实用性一般指所用仪器配置是否全部可作为商品购得(实验室自己制造的仪器部件就欠实用)，样品处理方法是否简单易操作，分析时间是否合理，分析成本是否可被同行接受等。可靠性则包括定量的线性范围、检测限、方法回收率、重复性、重现性和准确度等。下面就简单讨论这几个可靠性参数。 1．方法的线性范围 即检测器响应值与样品量(浓度)成正比的线性范围，它主要由检测器的特性所决定。原则上。这一线性范围应覆盖样品组分浓度整个变化范围。线性范围的确定通常是采用一系列(多于3个)不同浓度的样品进行分析，以峰面积(或峰高)对浓度进行线性回归。当相关系数大于0．99时，就可认为足线性的，小于0．99时，就超出了线性范围。一个好的GC定量方法，其线性范围(以FID检测器为例)可达10；，线性相关系数等于或大于0．9999。 2．方法的检测限 检测限(DL)是指方法可检测到的最小样品量(浓度)。一般的原则是按照3倍信噪比计算，即气样品组分的响应值等于基线噪声的3倍时，该样品的浓度就被作为最小检测限，与此对应的该组分的进样量就叫做最小检测量-此外。忆验证定量方法时，还将10倍信噪比所对应的样品浓度叫做最小定量限，当用于法规分析时，这一数据应等于或低于法规方法所要求的实际样品中待测组分的最低允许浓度。 检测限的测定可用一个接近检测限浓度的样品进行分析，据所得色谱峰的峰高来计算。设此时浓度为c、相应的峰高为h(信号强度单位)、基线噪声为N(与h的单位相同)，则检测限可按下面公式计算： c／h＝DL/3N；即DL＝3Nc／h 噪声的大小与仪器的性能，特别是检测器及其电子电路的稳定性直接相关，也与载气的纯度、色谱柱的性能及操作条件有关。噪声的测定是在正常操作条件下，仪器稳定时，将信号放大(降低衰减或放大纵坐标)来测量，一般是测定样品出峰前后1min的基线噪声。 作为分析方法，检测限无疑是越低越好。为此，应选择灵敏度高的检测器，使用高纯度的载气和辅助气，同时要定期维护仪器，保持进样口和检测器的清洁，保持色谱柱的性能。此外，仔细优化分离条件、适当加大进样量(如采用大体积进样技术)也是降低检测限的常用方法。 3．方法回收率 即方法测得的样品组分浓度与原来样品中实有浓度的比率。如果样品未经任何预处理，则回收率一般可不考虑。只有当某些样品组分被仪器系统不可逆吸附时，回收率才是需要考虑的问题。如果样品经过了预处理，如萃取工艺，那就必须考虑整个方法的回收率。一般要求回收串大于60％，越接近100％越好。 回收率可用下述简单方法测定：配置一定浓度的标准样品，将其两等分，其中一份按方法步骤进行预处理，然后用GC分析。另一份则不经颈处理而直接用GC分析。两份样品所得待测组分峰面积的比率乘以100即是该组分的回收率。有时实际样品很复杂，特别是样品基质对预处理的回收率影响较大时，就必须用空白样品基质(确信不含待测物)制备标准样品，比如测定废水中有机农药残留量时，就要采用不含农药的水作空白基质，在其中加入已知量的农药标准品，然后进行处理和分析。处理后测得的组分含量与处理前加入量的比率乘以100就得到了回收率。 很显然，回收率太低时会影响方法的检测限。当样品处理过程较复杂时，应分步测定回收率，最后针对回收率最低的步骤进行方法改进，以期提高整个方法的回收率。 4．方法重复性和重现性 重现性(reproducibility)足指同一方法在不同时间、地点、不同型号仪器、不同操作人员使用寸所得结果的一致性。与此近似的另一个术语是重复性(repeatability)，常指同一个人在同一台仪器上重复进样所得结果的一致性。事实上，文献中二者常常混用，多数人不做严格区分。但大多数欧洲学者会严格区分二者的不同。我们认为对现代仪器来说，分析重复性是容易实现的，而重现性则是更重要的，也是方法验证所必须考察的。重现性和重复性都用多次分析所得结果的相对标准偏差(RSD)来表示。 方法的重现性应包括多次连续进样分析的重复性、不同时间(天与天之间)分析的重复性、不同型号仪器之间的重现性和不同实验室之间的重现性。作为方法开发人员，首先应测定重复性，即在相同条件下连续进样5—10次，统汁待测组分的保留时间和峰面积(或峰高)的RSD，一般要求保留时间的RSD不大于1％，峰面积的RSD不大于5%。文献报道的最佳重复性数据为保留时间的RSD小于0.1%，峰面积的RSD小于1%。 如果样品要经过预处理，还应测定同一样品多次处理的重复性。即同一样品取3—5份做平行处理，看最后测定结果的重复性。这一RSD值应不大于5％。当然，有些工业分析要求不大于10％即可。至于天与天之间的重现性也不应大于10%、 当上述重复性满足要求后，说明该方法在你的实验室