研究生实验二（完整）.pptVIP

BD ELISPOT原理 1.ELISPOT实验设计是在96微孔培养板底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。 2.静脉血PBMC经适当分离处理后分配到微孔上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆性T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。 3.微孔板中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步使用 生物素（Biotin）标记的一抗来标识，其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。 BD ELISPOT 流程 BD ELISPOT 流程 BD ELISPOT 流程 ELISPOT 结果显示 BD ELISPOT 结果分析 BD ELISPOT 操作注意事项1 1.操作时注意不要触及PVDF膜的底部。 2.为获得优化的实验结果，在第一次实验时可使用不同的细胞浓度（103~106cells/microwell)。 3.在细胞培养过程中不要摇动ELISPOT板，防止斑点模糊。 4.在培养箱孵育过程中，不要将ELISPOT板重叠，防止边缘效应。 ChampSpotⅡ酶联斑点分析系统简介 ELISPOT酶联斑点分析软件和ELISPOT计数分析软件 1、完成整块板的计数只需5个步骤。 2、整块板的采集、分析、数据保存、输出，在15分钟内完成 3、强大的斑点处理功能 4、图象自动修复：可自动减切修复每个孔的内圈图象，有效的区分了孔壁与孔底的连接处。 5、具有单、双、多色斑点分析功能。 6、分析模式：给用户提供全自动、半自动、手动三种分析模式，同时可任意指定对整块ELISPOT板、列、行或单个微孔进行分析。 * * 实验二、ELISPOT  —单细胞分析技术 基础医学院免疫学教研室 徐琦 副教授 ELISPOT简介 ELISPOT是在ELISA 技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。 可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞，并具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用。 ELISPOT技术的发展 ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky 等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。 早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。 直到1996年PVDF薄膜的应用（Forsthuber et al., Science, 1996），才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。 1996年以来随着抗体制备、PVDF膜等技术改良，ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特异性T细胞的体外检测技术。 ELISPOT与ELISA的比较 它们最大的不同在于： 1. ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。 2. ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率; 3. 由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。  4. 刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。  106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数量的IFN-γ+的T淋巴细胞 ，经下列方法检测： ELISPOT 细胞内细胞因子染色（FACS） ELISA X坐标： 106 APC中实际IFN-γ+T细胞数量 Y坐标： 各检测方法的检测结果 ELISPOT/FACS/ELISA 检测精确度比较 BD ELISPOT 技术优势 单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子 观察活细胞应答（动态）结果能计数效应细胞，分析效应分子产生频率 ＃of Spots