细菌内毒素检查验证方案模板.doc

文件编号：**-**-** 验证文件 注射用******** 细菌内毒素检查法验证方案 ********公司 目 录 1 适用范围 2 目的 3 责任人 4 样品的来源 5.2 干扰实验 5.3 供试品的内毒素检查 7 注射用********细菌内毒素检查方法 1 适用范围 本验证方案适用于注射用********细菌内毒素检查法的验证。 2 目的 建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3 责任人 细菌内毒素检验员、QC主管。 4 样品的来源样品的来源℃1小时灭菌处理后使用。 4.2 实验准备 4.2.1 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。 4.2.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。 5 内毒素限值的确定 根据2010年版中国药典二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法中规定，细菌内毒素限值计算公式： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，本品以EU/mg表示； K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5EU/（kg．h）； M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。本品以腺苷蛋氨酸计最大剂量为1000mg。 L=5EU/（kg．h）*60kg*1h/1000mg=0.3EU/mg 因此本品的细菌内毒素限值为0.3EU/mg。 6 具体验证步骤 6.1 鲎试剂灵敏度复核 6.1.1 实验操作 6.1.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备 取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。 按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟。 6.1.1.2 待复核鲎试剂的准备 取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。 6.1.1.3 加样 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4 支（管）4 列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。 6.1.1.4.加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2 分钟。 6.1.1.5 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－ 6.1.2 实验结果计算 如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。 λc = lg-1 (∑X/4) 式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。 6.1.3 结果判断 6.1.3.1 判断标准 当λc在0.5λ～ 6.2.1 确定最大有效稀释倍数（MVD） 样品溶液的制备：取注射用********适量（约相当于含腺苷蛋氨酸500mg）加入注射用溶剂5ml，再用细菌内毒素检查用水稀释至每1ml含腺苷蛋氨酸10mg的溶液。本品内毒素限值为0.3EU/mg。 MVD=cL/λ L=0.