RNA干扰技术在生物医药发展的意义与前景要点.pptx

RNA干扰技术在生物医药发展的意义与前景;梅洛(Craig Mello)生于1960年，是被恐龙骨引入科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。;;1.RNAi的发现;1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。 利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上的解释正好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。 ;1998年，fire和mello对以上实验进一步研究： ;电泳结果显示上述的正义和反义RNA混合物的主要成分是dsRNA。 进一步研究表明只有与靶基因mRNA有同源序列的dsRNA才具有干涉作用。 由此他们认为，Guo实验中令人意想不到的结果是由于对照组正义RNA中混有少量dsRNA的缘故。 于是，Fire和mello提出在C．elegans体内dsRNA对有其同源序列的mRNA表 达具有高效的干涉作用。并将这一现象称为RNA干扰。 ;1.RNAi的发现;2.RNAi的机制;;RNAi：是指在进化过程中高度保守的、由dsRNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，也就是序列特异性的转录后基因沉默。;2.RNAi的机制;1、siRNA的形成 ;;2、siRNA介导的mRNA 降解 3、RNAi效应的放大 ;;;3.RNAi在生物医药方面的应用;3.RNAi在生物医药方面的应用;AIDS（获得性免疫缺陷综合征） HIV（人体免疫缺陷病毒） Corecepter—CCR-5 设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi抑制了coreceptor-CCR5进入人体外周Ｔ淋巴细胞。由此治疗HIV-1病毒感染性疾病的可行性大大增加。;Lieberman J成功地利用RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎 HBV（乙型肝炎病毒） Fas基因 实验：给实验鼠尾部静脉注入siRNA，以“沉默”Fas基因 结果：90%肝细胞接受这种RNA分子，并且使得Fas蛋白含量降低到10%；接受治疗的小鼠成活率为82.5%；而未接受治疗的小鼠有40%在3d内死亡。 不能用于人类。;肿瘤 传统技术：单个癌基因 RNAi：针对具有同源性的多个基?? Kras基因 抑制血管生成;慢性疼痛 RNAi是一种有潜力的新方法 ，通过导入可选择性降解疼痛相关蛋白的siRNA，从而解除疼痛，而且作为新的基因敲除手段，可用于发现疼痛通路中的新基因。 2003年，有人向鞘内注射靶向P2X3受体siRNA，有效降低了机械性痛觉过敏和触觉超敏。 这个结果表明RNAi可作为慢性疼痛研究与治疗一条新的途径。;3.RNAi在生物医学方面的应用;;4.RNAi的研究方法;（1）siRNA的序列应当选择靶基因的外显子序列，而且要避免距离起始密码和终止密码很近的地方； （2）避免连续的3个G； （3）不要针对5’和3’端的非编码区； （4）GC含量最好在45~55%之间； ;4.RNAi的研究方法;4.RNAi的研究方法;4.RNAi的研究方法;4.RNAi的研究方法;siRNA表达载体;siRNA表达框架(siRNA expresion casetes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 ;转染方法;作为靶点的选择； siRNA的有效导入； 如何将RNAi技术运用 到临床试验； siRNA在细胞中的 稳定性； ;