皮肤变态反应试验.doc

PAGE 1 PAGE 101 六、皮肤变态反应试验 Skin Sensitisation Test 1 范围 本规范规定了动物皮肤变态反应试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 406, July 1992) USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines (Series 870.2600, Aug.1998) 3 试验目的 确定重复接触化妆品及其原料对哺乳动物是否可引起变态反应及其程度。 4 定义 4.1 皮肤变态反应（过敏性接触性皮炎）（Skin sensitization，allergic contact dermatitis） 是皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。在人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征。动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。 4.2 诱导接触(Induction exposure) 指机体通过接触受试物而诱导出过敏状态的试验性暴露。 4.3 诱导阶段(Induction period) 指机体通过接触受试物而诱导出过敏状态所需的时间，一般至少一周。 4.4 激发接触(Challenge exposure) 机体接受诱导暴露后，再次接触受试物的试验性暴露，以确定皮肤是否会出现过敏反应。 5 试验的基本原则 实验动物通过多次皮肤涂抹（诱导接触）或皮内注射受试物10d~14d（诱导阶段）后，给予激发剂量的受试物，观察实验动物并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强度。 5.1 实验动物和饲养环境 一般选用健康、成年雄性或雌性豚鼠，雌性动物应选用未孕或未曾产仔的。 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制，需注意补充适量Vc。 5.2 动物试验前准备 试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d~5d时间。将动物随机分为受试物组和对照组，按所选用的试验方法，选择适当部位给动物备皮（去毛），避免损伤皮肤。试验开始和结束时应记录动物体重。 5.3 无论在诱导阶段或激发阶段均应对动物进行全面观察包括全身反应和局部反应，并作完整记录。 5.4 试验方法可靠性的检查 使用已知的能引起轻度/中度致敏的阳性物每隔半年检查一次。局部封闭涂皮法至少有30%动物出现皮肤过敏反应；皮内注射法至少有60%动物出现皮肤过敏反应。阳性物一般采用2,4-二硝基氯代苯，肉桂醛，2-巯基苯并噻唑或对氨基苯酸乙酯。 6 试验方法 6.1 局部封闭涂皮试验（Buehler Test, BT） 6.1.1 动物数 试验组至少20只，对照组至少10只。 6.1.2 剂量水平 诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度，激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。试验浓度水平可以通过少量动物（2~3只）的预试验获得。 水溶性受试物可用水或用无刺激性表面活性剂作为赋形剂，其它受试物可用80%乙醇 （诱导接触）或丙酮（激发接触）作赋形剂。 6.1.3 试验步骤 6.1.3.1 试验前约24 h ，将豚鼠背部左侧去毛，去毛范围为4 cm2~6 cm2 。 6.1.3.2 诱导接触：将受试物约0.2mL（g）涂在实验动物去毛区皮肤上，以二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定6 h。第7d和第14d以同样方法重复一次。 6.1.3.3 激发接触：末次诱导后14~28d，将约0.2mL的受试物涂于豚鼠背部右侧2cm×2cm 去毛区（接触前24h脱毛），然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布固定6h。 6.1.3.4 激发接触后24h和48h观察皮肤反应，按表1评分。 6.1.3.5 试验中需设阴性对照组，使用6.1.3.2和6.1.3.3的方法，在诱导接触时仅涂以溶剂作为对照，在激发接触时涂以受试物。对照组动物必须和受试物组动物为同一批。在实验室开展变态反应试验初期，或使用新的动物种属或品系时，需同时设阳性对照组。 表 1 变态反应试验皮肤反应评分 皮肤反应 积 分 红斑和焦痂形成 无红斑 0 轻微红斑（勉强可见） 1 明显红斑（散在或小块红斑） 2 中度~重度红斑 3 严重红斑（紫红色）至轻微焦痂形成 4 水肿形成 无水肿 0 轻微水肿（勉强可见） 1 中度水肿（皮肤隆起轮廓清楚） 2 重度水肿（皮肤隆起约1mm或超过1mm） 3 最高积分 7 6.1.4 结果评价 6.1.4.1 当受试物组动物