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LightCycler480荧光定量PCR技术原理 罗氏诊断产品 （上海）有限公司 应用专员 胡旭霞 800-820-0577 Roche Applied 1 Science 主要内容  普通PCR与荧光定量PCR区别  荧光定量PCR的检测模式  荧光定量PCR技术平台的功能开发 Roche Applied 2 Science 1 实时荧光定量PCR技术 典型PCR扩增曲线  在实时荧光定量 PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR反应 的进行， PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过 一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化 监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线 Roche Applied 3 Science 荧光阈值 把 PCR反应的前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 荧光域值的缺省设置是3-15个循环荧光信号的标准偏差的 10倍 Roche Applied 4 Science 2 定量的理论基础 检测信号理论方程 Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs 总信号 本底信号+分子数量单位信号强度 n = lg (R R / R X ) / (1+ E) n－ B s 0 当循环次数n=C 值时： T logX log(R - R ) - logR C O + T B S T log(1+ E ) log(1+ E ) X X 即 CT = - k lg X0 + b (线性方程，C 和起始模板浓度成反比 ) T Roche Applied 5 Science CT值 (cycle threshold)/Cp值 (crossing point)  每个反应管内的荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的 循环次数，即从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数  每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷 贝数越多Ct值越小 •浓度每增加 10倍， CT值减小 3.3个单位 Roche Applied 6 Science 3 qPCR定量前提：Cp值具高度重现性 PCR循环在到