G–CSF的定点PEG化修饰–谭小军报告.pptVIP

G-CSF的定点PEG化修饰 报告人：南京大学 谭小军 二〇〇八年十一月 G-CSF (粒细胞集落刺激因子) G-CSF生理功能 促进造血干细胞向中性粒细胞增殖、分化 动员成熟中性粒细胞从骨髓进入外周 G-CSF的应用 抗肿瘤化疗、放疗以及骨髓移植手术后重要的辅助药物 G-CSF的应用现存问题 体内半衰期短 易被酶水解和肾脏清除 多次注射引起不良反应 PEG(聚乙二醇) 具有良好的生物相容性 无毒性 无抗原性 修饰后的蛋白和多肽类药物的药代动力学和药效学性质能够得到改善 在国内外已经得到比较多的应用 项目概要 概括和总结现有蛋白质和多肽类药物的化学修饰方法； 选用合适的PEG对重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）进行选择性的定点修饰 改善rhG-CSF的各项性能，例如延长其在人体内的半衰期，降低其免疫原性而尽量不影响其生物活性，提高其临床应用价值 最佳条件反应结果 放大反应分离纯化 PEG(5 kD)-G-CSF纯品 PEG(20 kD)-G-CSF纯品 Mono-PEG-G-CSF纯品 Mono-PEG-G-CSF体外活性 Mono-PEG-G-CSF热稳定性 Mono-PEG-G-CSF pH稳定性 Mono-PEG-G-CSF体外稳定性 Mono-PEG-G-CSF的体内活性 结论 致谢 感谢导师陈钧辉教授的悉心指导 感谢聂永军老师、沈杰师兄的热情帮助 感谢苏州中凯生物公司免费提供rh-G-CSF样品 感谢南京大学创新计划项目管理办公室的辛勤管理与大力支持 在确定PEG化修饰仍保留rhG-CSF活性的前提下，我们对单修饰产品的体外稳定性进行了一系列检测。结果显示，除了在中性pH、37℃条件下，未修饰产品和单修饰产品均长时间保持很高稳定性；其他体外条件下，两种单修饰产品均比未修饰产品具有更高的稳定性。这两个图都是中性pH。左边是37度，64小时以后三种G-CSF都保持了90以上的活性。右边是60度，在4-8小时以后，未修饰rhG-CSF的活性仅为单修饰产品的三分之一。 * * mPEG-PAL一端的甲氧基相对惰性 G-CSF的Ｎ端氨基与侧链氨基的等电点差 =〉mPEG-PAL另一端醛基在偏酸性条件下特异性地与蛋白质N端氨基发生反应 mPEG-PAL（单甲氧PEG丙醛） 最佳修饰反应条件的摸索！ Figure 1. SDSanalysis of the orthogonal samples stained with Coomassie Blue. Lane 1-9: nine samples in the orthogonal tests corresponding to the test number. 正交实验确定最佳反应条件 The Optimal Conditions: Time：48 hours pH：5.0 Temperature：20 ℃ Molar ratio PEG/rhG-CSF：10:1 Figure 2. Much mono-PEGylated rhG-CSF was obtained under the optimal conditions (48 h, pH5.0, molar ratio of mPEG to rhG-CSF 10: 1; 20 ℃), more than under the conditions of Test 5 or 7 in the orthogonal tests. A B Figure 3. The profile of cation exchange fast protein liquid chromatogram (?CTA FPLC) of the PEGylated rhG-CSF. The average molecular weights of mPEG-PAL used are (A) 20 kDa and (B) 5 kDa, respectively. Figure 4. The FPLC profile of PEG(5 kD)-G-CSF after purification. Figure 5. The FPLC profile of PEG(20 kD)-G-CSF after purification. LANE A: Marker LANE B: Mono-PEG(5 kDa)-G-CSF LANE C: Mono-PEG(20 kDa)-G-CSF LANE D: G-CSF Figure 6. SDSanalysis of the