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10质粒DNA转化大肠杆菌要点
* * 十、质粒DNA转化大肠杆菌 1. 实验目的 掌握重组质粒DNA利用CaCl2法转化大肠杆菌的原理和方法。 2. 实验原理 2.1转化率的影响因素 转化率的高低对于一般重组克隆实验关系不大，但在构建基因文库时，保持较高的转化率至关重要。影响转化率的因素很多，其中包括： 1）载体DNA及重组DNA： 载体本身性质决定了转化率的高低，不同载体DNA转化同一受体细胞，其转化率明显不同。载体分子的空间构象对转化率也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往具有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间构象改变，其转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低。 2）受体细胞： 受体细胞一般要求具有限制重组缺陷性，而且应与所转化的载体DNA性质相匹配，如pBR322转化大肠杆菌JM83株，其转化率不高于103/mg DNA，但若转化ED8767株，则可获得106/mg DNA的转化率。 3）转化操作： 受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。对于Ca2+诱导的完整细胞转化而言，菌龄、CaCl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热脉冲时间均是很重要的因素，其中感受态细胞通常在12-24小时内转化率最高，之后转化率急剧下降。 4）试剂纯度与器皿的洁净度： 转化过程中，所用的试剂（CaCl2，甘油，水）必须是高纯度的。所用器皿尽量酸洗后乙醇洗涤，超声后用超纯水淋洗。 3. 试剂与器材 1. 材料：p1300-TaSTK质粒、DH5a大肠杆菌感受态菌液 2. 试剂：LB液体培养基、含有100μg/ml Kan抗生素的LB固体培养基、40mg/ml IPTG, 40mg/ml X-Gal(二甲基甲酰胺DMF配制，避光保存) 3. 仪器：摇床、培养箱、超净工作台、超低温冰箱、水浴锅 4. 其他：涂棒 、微量移液器 4. 实验步骤 （1）从-80℃超低温冰箱取一管大肠杆菌感受态细胞（200μl），4℃融化. （2）在感受态菌液中加入10μl p1300-TaSTK质粒溶液，轻轻混匀，冰水浴中放置30min. （3）取出后在42℃水浴热激90Sec，快速转移至冰水浴中放置2min. （4）在超净工作台加入1ml LB培养基，37℃摇床复苏培养0.5～1.0h. （5）复苏培养结束前10min, 在超净工作台上各吸取20μl 40mg/ml IPTG和40mg/ml X-Gal，滴加到LB固体培养基上，利用涂棒铺匀，吹干. *
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