富铬米曲霉生工13要点.docxVIP

富铬米曲霉性质的研究目的学会用分光光度计法测定三价铬离子。了解环境中各种因素对米曲霉富集三价铬的影响。学习胞内多糖的提取方法以及定量测定的方法。掌握菌体内CAT、SOD酶活和谷胱甘肽含量的测定方法。原理铬是“中国环境优先污染物黑名单”上优先监测的重金属之一。铬的化合物中Cr6+、Cr3+毒性依次减小，金属铬可以认为无毒。用微生物方法清除环境中的铬是当前研究的热点。但微生物在环境中吸收重金属是其生理功能的一种表现，微生物在自然环境中的生长受到各种因素的影响。同样每一种微生物对各种金属元素的吸收功能受到环境因素的影响也是比较大的。为了更好地利用微生物来富集金属离子，就要深入的研究微生物吸附重金属效率的影响因素。溶液中Cr3+的去除过程大致为：价键作用结合到微生物细胞表面、转移到细胞内部。谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用。在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量很高，机体新陈代谢产生的过多自由基会损伤生物膜，侵袭生命大分子，谷胱甘肽具有多方面的生理功能，它的主要生理作用是能够清除掉自由基，Cr3+对米曲霉有毒性，主要表现在对生物膜的损伤，谷胱甘肽可以有效减少生物膜的损伤。真菌多糖是一种特殊的生物活性物质，它可以与金属离子结合从而降低金属离子对生物体的损伤。多糖是极性大分子化合物，溶于水，不溶于乙醇。常用的提取方法有热水浸提、稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、超声抽提法、酶提法，以及超临界流体萃取法。抗氧化酶是超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等的统称。一旦在机体内形成过氧化物，它们即刻发挥作用，利用氧化还原作用将过氧化物转换为毒害较低或无害的物质。因此抗氧化酶活的指标是衡量米曲霉抗氧化损伤的重要指标之一。材料与方法菌种米曲霉（Aspergillusoryzae）试剂铬溶液（CrCl3 40g/L）：称取三氯化铬4g，溶于水并定容至100mL。磷酸溶液（1：1）：取分析纯磷酸30mL加入30mL蒸馏水。高锰酸钾溶液（40g/L）：取4克高锰酸钾固体，溶于蒸馏水并定容至100mL。浓硝酸（分析纯）氢氧化钠溶液：过饱和、0.5mol/L 、1mol/L、2mol/L盐酸溶液：0.5mol/L 、1mol/L、2mol/L尿素（200g/L）：取20g尿素固体，溶于水并定容至100mL。亚硝酸钠（20g/L）：取2g亚硝酸钠固体溶于水定容至100mL。显色剂：取二苯碳酰二肼0.1g，溶于25ml丙酮，加水定容至50ml，于棕色瓶中避光低温保存。80%浓硫酸（分析纯）：取77mL 98%浓硫酸加入到23mL水中。蒽酮试剂：称取0.1g蒽酮，溶解于50mL80%硫酸中即得。葡萄糖标准液（200mg/L）：准确称取110℃烘干至恒重的葡萄糖20.0mg，用水溶解，定容至100m1。邻苯三酚（焦性没食子酸）：用10mmol/L HCl配置成50mmol/L的溶液，新鲜配制。50mmol/L、pH 7.5磷酸钠盐缓冲液20mmol/L H2O2溶液：取227μL的30% H2O2溶液，用50mmol、pH 7.5磷酸缓冲液稀释至100mL，现用现配，低温避光保存。pH 8.3，50mmol/L的磷酸钠缓冲液。0.25mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲溶液：称取Tris30.2g，加入蒸馏水800mL搅拌溶解，加入浓盐酸10mL，室温下调节pH至8.0，定容至1L。磷酸盐缓冲溶液：取磷酸二氢钠6.8g，庚烷磺酸钠2.2g，用磷酸调pH至3.0，加超纯水定容至1L。DTNB溶液：用DTNB加0.05mol/L pH 3.0的磷酸盐缓冲溶液配成0.01moL/L的溶液，存在于棕色瓶中低温暗处备用，使用时用0.25moL/L的Tris-HCl缓冲溶液配成0.1mmoL/L的DTNB溶液。培养基液体培养基： 3%蔗糖，1.5%酵母膏，pH 6左右，装液量为250mL三角瓶装60ml 121℃20min灭菌。固体培养基：2%琼脂，3% 蔗糖，1.5%酵母膏，pH 6左右，121℃20min灭菌，倒平板。仪器（1）容量瓶：100mL、50mL；（2）试管；（3）三角烧瓶：100mL、250mL；（4）电炉（5）分光光度计；（6）水浴锅；（7）pH计铬含量的测定原理：Cr3+与显色剂不发生显色反应，需先将Cr3+氧化成Cr6+，与二苯碳酰二肼发生显色反应，溶液呈紫红色。为了排除其他金属离子的影响，实验用水应用蒸馏水。（1）标准曲线的测定将配制好的铬标准液进行梯度稀释后，获得20 mg/L， 40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L，100 mg/L，120 mg/L，140 mg/L，160 mg/L，180 mg/L，200 mg/L，取1.0mL液体加入1.5mL磷酸溶液，后加蒸馏水至25mL，转