实验十一cDNA合成技术.pptVIP

实验九、cDNA合成技术 概述： 由于多数真核基因中含有内含子（Intron），需要从拼接的成熟mRNA中获得完整的能表达的基因，故需要通过cDNA进行克隆。 cDNA是以 mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的序列可代表mRNA序列。 cDNA文库指通过克隆的方法保存在寄主中的一群混合分子，这些分子中的插入片段的总和可代表某种生物的全部mRNA序列。它是通过反转录酶将各种mRNA转变成cDNA, 然后与合适的载体重组并导人到寄主中。 从mRNA合成cDNA的反转录酶主要有二种：禽酶（AMV）和鼠酶（M-MLV）. 禽酶（AMV）由两条肽链组成, 有聚合酶活性和很强的Rnase H活性; 最适温度为42℃, 最适pH为8.3. 鼠酶（M-MLV）由一条肽链组成, 有聚合酶活性和较低的Rnase H活性; 在42℃下很快失活; 最适pH为7.6. 目前许多公司可提供AMV-cDNA合成试剂盒或M-MLV(H-)-cDNA合成试剂盒. RiboClone M-MLV(H-)cDNA技术（Promega） 该RiboClone M-MLV(H-)cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶，使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成法使用M-MLV反转录酶，cDNA第二链合成采用置换合成法，采用RNase H和DNA聚合酶I进行置换合成，最后用T4DNA聚合酶切去单链末端，方法简便易行。 操作步骤 第一链合成： A. 取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和适当引物，每微克RNA使用0.5ug引物（如使用Not I引物接头，使用0.3ug）,用水调整体积至15ul，700C处理5分钟，冷却至室温，离心使溶液集中在管底，再依次加入： 5X第一链缓冲液 5ul rRNasinRNA酶抑制剂 25单位 M-MLV(H-)反转录酶 200单位 H2O调至总体积 25ul B. 用手指轻弹管壁，吸取5ul至另一eppendorf管，加入2-5单位 [α-32P]dCTP(400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。 C. 37℃（随机引物）或42 ℃ （其他引物）温浴1小时。 D. 取出置于冰上。 掺入测定 A. 掺入测定的eppendorf管加入95ul 50mmol/L EDTA终止反应，并使总体积为100ul。 B. 可取90ul进行电泳分析（先用苯酚抽提），另10ul进行同位素掺入放射性活性测定。 第一链eppendorf管可直接用于第二链合成。 第二链合成 第二链合成 A、取第一链反应液20ul，再依次加入 10X第二链缓冲液 20ul DNA聚合酶I 23U RNase H 0.8U H2O调至总体积 100ul B、轻轻混匀，如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定，可取出10ul至另一eppendorf管，加入2-5单位Ci[α-32P]dCTP。 C、140C水浴2小时（如需合成长于3kb的cDNA，则需延长至3-4小时）。 D、掺入测定eppendorf管中加入90ul50mmol/L EDTA,取10ul进行同位素掺入放射性测定，余下的可进行电泳分析。 E、cDNA第二链合成离心管反应液700C处理10分钟，低速离心后置冰上。 第二链合成（续） 加入2单位T4DNA聚合酶，370C水浴10分钟。 加入10ul200mmol/L EDTA终止反应。 用等体积酚：氯仿抽取cDNA反应液，离心2分钟。 水相移至另一eppendorf管，加入0.5倍体积的7.5mol/L醋酸铵（或0.1倍体积的1.5mol/L醋酸钠，pH5.2），混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇（-200C），-200C放置30分钟后离心5分钟。 小心弃去上清液，加入0.5ml冰冷的70%乙醇，离心2分钟。 小心移去上清液，干燥沉淀。 沉淀溶于10-20ul TE缓冲液。 其他cDNA合成技术 除RiboClone M-MLV(H-)cDNA技术外，许多公司还提供有多个AMV合成试剂盒，不同试剂盒所提供的引物或引物-延接头（primer