蛋白质组学的研究策略与应用精要.ppt

4.4 数据处理（结构预测） 蛋白质结构预测主要有两大类方法： 1、理论分析方法或从头算方法（Abinitio）： 2、统计方法：该类方法对已知结构的蛋白质进行统计分析，建立序列到结构的映射 模型，进而对未知结构 的蛋白质根据映射模型 直接从氨基酸序列预测 结构。 经验性方法 结构规律提取方法 同源模型化方法 25-30%同源序列， 相似的空间结构 蛋白质数据库的构成图 蛋白质功能确定的思路与方法 通过相似序列的数据库比对确定功能 确定序列特性：疏水性、跨膜螺旋等 通过序列模体数据库等的比对确定功能 相互作用 规模化发现蛋白质相互作用技术 酵母双杂交 基于质谱的蛋白质复合体研究 蛋白质芯片 蛋白质相互作用验证技术 ? 免疫共沉淀 ? GST-pull down ? 荧光共定位 ? 荧光共振能量转移（FRET) ? 体外表达 ?…… 定量蛋白质组中的实验设计 应用举例 应用举例 * * * 酚类复合物(植物): - 还原状态: 通过氢键与蛋白结合 - 氧化状态(醌): 发生共价结合 - 处理方法: - 添加polyvinylpolypyrrolidone (PVPP):形成多酚物 - 添加还原剂(DTT, 抗坏血酸, 亚硫酸盐) 不溶物质: - 阻塞凝胶孔道导致聚焦不好(出现严重的拖尾) - 去除方法: 高速离心(e.g. 40000g, 30 min, 20°C) 去除影响样品制备的干扰物质 样品制备中的纯化处理效果 E.coli cell lysates spiked with 1% SDS 采用TCA/丙酮沉淀法处理 未处理 血浆蛋白质组的动态范围 整体蛋白质组预分离分析技术路线 4.2 分离技术 特定或目标蛋白质组分离分析技术 4.2 分离技术 整体蛋白质或肽段混合物分离方法选择： 依据形状和大小，如超滤、体积排阻、PAGE等； 依据溶解性或密度性质，如丙酮沉淀、蔗糖梯度密度离心技术； 依据等电点不同，如离子交换、等电聚焦； 依据疏水性不同，如反相色谱、疏水色谱； 依据亲和性不同，如亲和色谱； 依据与金属离子螯合性质不同，如IMAC法提取磷酸化肽段； 依据特殊化学反应基团，如巯基填料选择性富集含巯基的肽段。 常用的两种高效分离技术 2DE（MALDI-TOF/TOF MS） 非胶多维分离-质谱分析（液相色谱和毛细管电泳等） 4.3 鉴定技术 生物质谱 ? 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 ? 电喷雾电离质谱 ? 串联质谱 生物质谱的应用 蛋白质鉴定 分子量测定：蛋白酶切 + 一级质谱 蛋白质的氨基酸序列测定 蛋白酶切 + 二级（串联）质谱 翻译后修饰 糖基化、磷酸化……. 生物大分子非共价相互作用 微生物分析 蛋白质组 质谱仪与质谱分析 质谱仪：按离子质量数m与电荷数z的比值（称质荷比m/z）大小顺序排列，应用电磁学原理，分离和测定离子化了的分子或原子质量，它是一种物理方法，即物质粒子的质量谱。 质谱分析：测定样品离子的质荷比(m/z), 进行成分和结构分析的分析方法 [M+nH]n+ 质荷比: m/z=(M+n)/n m/z为质荷比，n为质子化数，即电荷数， M为分子质量 离子源的作用： 将样品中的原子、分子电离成为离子，并使这些离子在离子源系统中形成具有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。 生物质谱的分类 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-TOF-MS 离子源：基质辅助激光解吸电离(MALDI) 基本原理：将分析物分散在基质(Matrix)分子中并形成共结晶, 当用激光(337nm的氮激光)照射晶体时, 基质分子吸收激光能量与样品解吸附，基质－样品之间发生电荷转移使样品分子电离。 常用基质(激发波长337nm、355nm) 基质的作用 – 吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相,样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化学键的断裂。 - 基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。 电喷雾电离质谱(ESI-MS) 基本原理：利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子的形式进入质量分析器。 ESI源示意图 串联质谱 质量分析器的作用：使离子按照质荷比的大小进行分离，并得到按质荷比大小顺序排列成的谱图－质谱图。 有机质谱和生物质谱常用的质量分析器有： a 磁场(或电场)质量分析器； b 四极杆质量分析器； c 飞行时间质量分析器； d 离子阱质量分析器； e 离子回旋共振