人体血管瘤动物模型的生物学特性及其凋亡的初步研究.pdfVIP

人体血管瘤动物模型的生物学特性 及其凋亡的初步研究1 王勇，刘文英，唐耘熳 四川大学华西医院小儿外科 （610041） E-mail: summer0660@ 摘 要： 目的 研究人血管瘤裸小鼠移植模型中不同时期移植瘤增殖和凋亡情况。 方法 将手术切除的增殖期人血管瘤组织切分为小块，移植到裸小鼠皮下，取不同时期移植瘤作光 镜观察、CD31 和 KI-67、VEGF、糖皮质激素受体 （GR）免疫组化检测以及 TUNEL 凋亡指数测 定。 结果 移植瘤生长可分为缺血期、增生期和消退期。CD31 在各期增强阳性表达；Ki-67 在缺血期低表达，增生期高表达，消退期弱表达；VEGF 和 GR 在增生期高表达，消退期表达 极弱；凋亡指数在缺血期低，增生期达最低值 13.2，消退期表达增高，达 82.97。结论 移 植瘤的生长存在明显增殖和凋亡的变化。 关键词：血管瘤 动物模型 凋亡 增殖 1．引言 婴幼儿血管瘤 （简称血管瘤）是小儿最常见的肿瘤，其发病率约为 1-10%，其特点为出 生后早期出现并快速生长，继而自发缓慢消退。近年来国内外对血管生成的研究取得很大进 展，对血管瘤的细胞生物学、分子病理学和遗传学特性也有了较多了解，但血管瘤的增殖是 如何启动、又如何自然触发消退过程，机制仍然不清。有作者取来自不同个体的不同时期血 管瘤作内皮细胞增殖和凋亡的研究，提示血管瘤自然发展过程中存在增殖和凋亡平衡的变 化，由于不同血管瘤组织之间组织病理差异可能较大，故而在同一组织来源的血管瘤组织中 作这类研究将更能反映血管瘤的动态变化情况。本课题组已成功建立起人血管瘤裸小鼠异种 移植模型，形态学研究表明该模型中移植瘤的生长过程与人血管瘤自然发展过程相似。在此 基础上，作者对不同时期移植瘤的生长进行了进一步研究。现报告如下。 2．材料和方法 2．1 人血管瘤组织来源 供移植用的人血管瘤组织来源于 1 例 2 月龄男婴，为腰背部快速生长的血管瘤。经病理 检查证实为增殖期血管瘤。 2．2 动物模型的制作和取材 1本课题得到教育部博士点基金资助（编号 200220610068 ） -1- 人血管瘤组织却除皮肤和皮下脂肪、筋膜组织后，切分为 5mm╳4mm╳3mm 小块，移植于 BALB/c nu/nu 裸小鼠皮下，每只 6 块，共 96 块。移植后第 2、5、7、15、30、45 天、2、3、 6 个月随机切取移植瘤。 2．3 HE 染色光镜观察 取材组织以 10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切 4-6μm 片，HE 染色，光镜下观 察组织学特点。 2．4 免疫组化染色 2．4．1 一抗。鼠抗人CD31 单克隆抗体（Santa Cruz, 美国）；鼠抗人 Ki-67 单克隆抗体(Santa Cruz, 美国)；兔抗人血管内皮细胞生长因子单克隆抗体 （Santa Cruz, 美国）；兔抗人、大 鼠、小鼠糖皮质激素受体抗体（Santa Cruz, 美国） 2．4．2 免疫组化染色。采用 SP 法免疫组化染色，按说明书进行操作，以 PBS 代替一抗同 步染色作为阴性对照。 2．4．3 阳性标准。细胞内见棕黄色颗粒状沉淀者为阳性，阳性细胞须细胞结构清晰、阳性 颗粒定位及定性好、着色明显高于背景。 2．4．4 阳性细胞百分率。在光镜下每张切片随机计数 500 个内皮细胞，以阳性细胞数占细 胞总数百分比计为阳性细胞百分率，Ki-67 阳性细胞百分率即增殖指数（PI）。 2．5 细胞凋亡检测 细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司，实验操作按说明书进行。以胞核呈棕色者为阳 性染色。在光镜下每张切片随机计数 500 个内皮细胞，以阳性细胞数占细胞总数百分比计为 凋亡指数（AI）。 3．结果 3．1 HE 染色光镜下表现 光镜下来源血管瘤组织呈典型增生期婴幼儿血管瘤表现，细胞密集，内有多个管腔不规 则的毛细血管。移