山东玫瑰花的过氧化物酶同工酶分析.docVIP

　　山东玫瑰花的过氧化物酶同工酶分析 【摘要】 目的建立山东不同品种玫瑰花药材的过氧化物酶同工酶鉴别方法。方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法。结果19个品种的玫瑰花过氧化物酶同工酶分析，显现出谱带1～5条，其中D1带和D2带是玫瑰的基本谱带。结论山东产玫瑰花各品种过氧化物酶同工酶的谱型较多，品种之间有较明显的差异，可作为玫瑰花栽培品种鉴别的依据，为玫瑰花的规范化栽培提供了资料。 【关键词】 玫瑰花；过氧化物酶同工酶；电泳；品种鉴别 　　Abstract：ObjectiveTo establish a Peroxidase isoenzyme(POD) method for identification of rugosa rose varieties in Shandong province.MethodsThe polyacrylamide gel electrophoresis method ograms of the 19 species ograms among rugosa rose varieties in Shandong can be used as a foundation， ation for normalized cultivation. 　　Key e； Electrophoresis； Variety identification 　　玫瑰花是蔷薇科植物玫瑰Rosa rugosa Thumb.的干燥花蕾［1］，具有行气活血、开窍化淤、疏肝醒脾的功效。在我国已有二千多年的栽培 历史 ，主产于山东、甘肃、安徽、浙江、河北、内蒙古等地［2］。山东作为玫瑰花的道地产区，汇集了当今玫瑰的主要品种。2005版《 中国 药典》对玫瑰花的质量标准收载的较少，并且在不少地区发现其混淆品现象。我们曾对山东玫瑰花的生产栽培情况进行了调查研究［3］，并对其进行了研究进展分析［4］、生药学研究［5］和挥发油的GCMS分析［6］。在此基础上，“山东玫瑰花的质量标准及方法研究”和“山东玫瑰花的生药学研究”课题组又利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对山东产19个品种的玫瑰花进行了过氧化物酶同工酶分析，为玫瑰花栽培品种的鉴别提供依据。 　　 1 材料与仪器 　　1.1 药材 　　采集各品种玫瑰花药材的茎尖、嫩芽，立即于4℃以下贮存备用。药物材料见表1。 　　1.2 仪器 　　DYYIII2稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂），DYCZ28A型垂直板电泳槽（北京市六一仪器厂），BCD225AG型电冰箱，电热恒温培养箱，离心机，JA1203型 电子 分析天平，真空干燥器，微量进样器，定量可调微量移液器，烧杯，量筒，刻度吸管，离心管，大培养皿，玻璃注射器，剪刀，研钵等。 　　1.3 试剂分离胶缓冲液，分离胶贮液，浓缩胶缓冲液，浓缩胶贮液，电极缓冲液，40%蔗糖溶液，过硫酸铵溶液，四甲基乙二胺，溴酚蓝指示剂，醋酸联苯胺显色液，脱色液等。所用生化试剂均为分析纯。 　 　2 方法 　　2.1 样品液的制备取新鲜样品2～5 g，加适量稀释4倍的电极缓冲液，冰浴研磨成匀浆，冷冻离心机中3 000 r/min离心15 min，取其上清液，加入等体积蔗糖溶液，混匀，存于冰箱内备用。整个制备过程中保持样品温度不超过4℃。表1 药物材料（略） 　　2.2 电泳槽的安装垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的由两个半槽组成的方形或长方形电泳槽。两半槽之间夹着凝胶模子，模子的两侧形成正负两个槽，供装电极缓冲液用。凝胶模子由两块玻璃装入一个塑料或硅酮橡胶的夹套内构成。 　　玻璃板先用热的去污剂轻轻擦洗或用洗液浸泡，然后用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，直立干燥，禁止用手接触洁净的玻璃板面。手持玻璃板两边，将两块玻璃板装入夹套内，然后垂直地放入半槽之间，长螺杆固定。上螺丝时，要按顺序逐步拧紧，均匀用力。电泳槽装好后，将琼脂熔化，趁 热注入正极槽的小池内，使在凝胶模子的下部凝结成约5 mm厚的琼脂层。 　　2.3 分离胶与浓缩胶的制备将分离胶缓冲液、分离胶贮液、过硫酸铵溶液、蒸馏水按1∶2∶1∶4的比例（V/V）混合，配成分离胶液16ml；将浓缩胶缓冲液、浓缩胶贮液、过硫酸铵溶液、40%蔗糖溶液按1∶2∶1∶4的比例（V/V）混合，配成浓缩胶液4 ml。将配好的两种胶液及20～50 ml新鲜蒸馏水置真空干燥器内抽气20 min。 　　分离胶液中加入四甲基乙二胺30 μl，混匀，立即缓缓注入已安装好的凝胶模子中，注意防止气泡。分离胶液上覆盖约3 mm后的蒸馏水，静置1 h以上，待分离胶与水层间界面清晰时，用滤纸条小心吸净水层。插上样品槽模板，使其底部距分离胶上层约1 cm。向浓缩胶液中加入四甲基乙二胺15 μl，混匀后注入凝胶模子中，静置3