实验4-革兰氏染色.docVIP

实验 细菌的革兰氏染色 ? ? 一、细菌的革兰氏染色革兰氏染色-及G+细菌细胞壁结构的特点； 了解革兰氏染色细菌实验原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G()和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。 革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。 该染色法所以能将细菌分为G(菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G(菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 、实验器材 1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种； 2、仪器 显微镜； 3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。 4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液、操作步骤 1、涂片 在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。 2、固定 将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 3、染色 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。 ⑵ 媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。 ⑶ 脱色 滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。 ⑷ 复染 滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。4、镜检 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G()；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。 、注意事项 1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。 2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3、选用培养16-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 细菌 第四周微生物实验：细菌的革兰氏染色 实验准备要求： 1、菌种 大肠杆菌枯草杆菌牛肉膏琼脂斜面28℃℃培养24h的新鲜斜面培养物； 2、仪器 显微镜； 3、材料 4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液2004-9-15 3