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质粒dna的碱法大量制备,实验报告 大量制备质粒DNA方法 SDS碱裂解法制备质粒DNA： 大量制备 用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化： 材料： 缓冲液和溶液： 碱裂解液I： 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl （pH8.0） 10mmol/L EDTA （pH8.0） （溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。） 碱裂解液II： 0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释） 1% （m/V） SDS （溶液II要现用现配，室温 下使用） 碱裂解液III： 5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 双蒸水（去离子水） 28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。） 另需： 乙醇 异丙醇 STE TE（pH8.0） 溶菌酶 （10mg/ml） 现在开始实验： 细胞的制备： 1. 挑取转化 细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。 注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。 b. 试管不宜盖的太紧 c. 应在剧烈振摇下温育 2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。 3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小 时。 注：最后菌液的OD600值应为0.4。由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短 培养时间，使最终的OD值为0.4。 4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。 注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。 5. 于37摄氏度，以300r/min剧烈振荡再培养12~16h。 6. 取部分菌液（1~2ml）到离心管中，4摄氏度储存。于4摄氏度，以2700g离心15min以收集余下的近500ml培养物。弃上清，倒置离心管使残余的上清流出。 7. 用200ml冰预冷的STE重悬细菌沉淀，按步骤6所述重新收集细菌并贮存于零下20摄氏度。 8. 用步骤6中贮存的1~2ml 菌液提取质粒，采用酶切和琼脂糖电泳分析此小量制备质粒，以确定大量培养菌液中正确的质粒已得到扩增。 注：设置这种对照可能看上去有点过于谨慎，然而它可以避免发生某些可能难以挽回、浪费大量时间的错误。 9、将步骤7中冻存的细菌在室温下放置5~10min使其解冻后， 用18ml（10ml）碱裂解液I重悬。 注：只有步骤4中使用了氯霉素的菌液才应参照括号中的体积数。 10、加2ml （1ml）新配置的10mg/ml溶菌酶。 11、加40ml（20ml）新配置的碱裂解液II。盖上离心管盖，轻轻颠倒数次，彻底混匀，室温下放置5~10min。 注：延长超螺旋DNA暴露于碱的时间会使其不可逆变性，所产生的环状卷曲DNA不能被限制酶内切，而且它在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率为正常超螺旋DNA的两倍，难以被溴化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提取质粒时可能 会看到微量的这种DNA。 12. 加20ml （15ml）冰预冷的碱裂解液III。盖上离心管盖，轻轻地但完全地振荡混匀几次（此时应不再有分离的两个液相）。 将离心管在冰上放置10min。 注：在放置过程中会出现由染色体DNA、高分子量RNA、钾离子/SDS/蛋白质/细胞壁复合物一起形成的乳白色沉淀。在碱裂解液III中最好使用醋酸钾而非醋酸钠，因为十二烷基硫酸钾盐远比钠盐难溶。 13. 在4摄氏度20，000g离心碱裂解液30min，无须制动，让转头自然停止。 将上清轻轻移入量筒中，弃去离心管中的沉淀。 注：不能形成紧密沉淀的原因常常是加入裂解液II时混匀不充分。如果细菌碎片不能形成紧密的沉淀，以20,000g再次离心15min，然后将上清尽量移入干净的离心管中。转移的时候使用四层纱布过滤上清可以除去黏稠的基因组DNA 和蛋白质沉淀残余。 质粒DNA的回收： 14. 量取上清的体积，将其连同0.6倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中并将其充分混匀，室温下放置10min。 15. 在室温下以12,000g离心15min回收核酸沉淀。 注：若在4摄氏度下离心会使盐也沉淀下来。 16. 小心弃去上清，将离心管敞开盖，倒置于纸巾上以除去残余的上清。在室温下用