2.4_Plant-vector.pptVIP

植物分子克隆载体 ; G-菌,可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor).冠瘿瘤细胞具有以下特征： i. 不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii.合成肿瘤特有的化合物—冠瘿碱(opine),能专一的为根癌农杆菌所利用.这两个特征由Ti质粒决定,但该质粒中仅有一部分进入植物细胞. ;根癌农杆菌及Ti质粒侵入植物细胞概略;Ti 质粒类型 i. 鱆鱼碱类(octopine) ii. 胭脂碱类(nopaline) iii.农碱类(agropine) 2) Ti 质粒的结构 i. 环状ds-DNA,160-250kb,具六个功能区 i) 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 ii) 冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成 iii) 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解 iv) Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移 v) 毒(性)区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体 vi) DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制; ii. T-DNA T-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25 bp重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧25 bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。 不同Ti 质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中 i) 胭脂碱Ti 质粒的T-DNA长23 kp,结构连续，具13个基因 ??? ii) 鱆鱼碱Ti 质粒中的T-DNA不连续，分左右两段，分别称之为TL和TR, TLDNA长13.2 kb,含8个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素合成基因, TR –DNA长7.9 kb，含5个基因，参与甘露碱(mannopine)和农碱合成 iii)两者同源性：主要集中在植物激素合成区。 ;Ti质粒的T-DNA的同源性 ; 1) Ti质粒作为载体的问题 ??????? i) 太大，无适合克隆位点 ???????ii) T-DNA的存在不能使转化细胞再生为完整植株 2) 载体类型 i)中间载体(intermediate vector) 由以下几部分组成： ?适合于E.coli和A.tumefaciens自主复制和选择用标记基因 ?适合于植物细胞选择用标记基因 ?一段来自天然Ti质粒的部分T-DNA序列(提供同源重组) ?1-2个来自T-DNA的25 bp重复序列 ?表达外源基因的DNA序列(如启动子、终止子序列); Genes of interest (goi) are exchanged into the T-DNA region of a Ti-plasmid (either oncogenic or disarmed) via homologous recombination. Following exchange, the exchange/co-integration vector can be cured (removed) from the Agrobacterium cell;重组DNA的转移过程： 中间载体或重组子 E.coli(中宿主) A.tumefaciens ? 在根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生共整合作用 感染植物受伤组织或与植物细胞共培养 T-DNA进入植物细胞并整合到染色体DNA中 外源基因表达;Ti载体的共整合作用 ; ii)非致瘤Ti质粒载体(disarmed Ti plasmid) 该类载体实际上是辅助载体，其特点是用pBR322 DNA取代了Ti质粒中参与植物激素合成基因序列，它可以与含有pBR322 序列的DNA发生同源重组，构成一个完整的重组DNA序列，然后转移至植物细胞。 如果在中间载体中插入一个T-DNA的25bp重复序列，在非致瘤Ti质粒载体中插入另一个25bp重复序列，经重组后形成一个完整的T-DNA，这种系统称之为分离末端载体系统(SEV,Split End Vector)。 ;非致瘤载体的重组;分离末端载体的共整合作用(SEV) ; iii)双末端载体(binary vector) Hoekema et al. (1983) and de Framond et al. (1983) determined that the vir and T