3.蛋白质与酶工程酶的提取、分离和纯化选读.ppt

蛋白质与酶工程;一、概述 二、酶的提取 三、酶的分离纯化 四、酶的结晶 五、浓缩与干燥 六、酶纯化步骤的设计及评价; 一、概述;1-2 提取纯化之目的 1)酶催化功能的应用 2)酶学研究 酶的结构、功能、催化机制、催化动力学 酶的生物合成及其调控规律等 1-3 纯化的必要性 1)生物细胞中同时存在多种多样的酶 2)多酶可能作用于同一个底物 3)酶在生物细胞中的分布并不是均一的;二、酶的提取（extraction);真核细胞内酶的分布 ①细胞膜：ATP酶、腺苷酸环化酶等 ②细胞核：DNA聚合酶、连接酶和RNA聚合酶等 ③线粒体：三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化、尿素循环、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白质合成、DNA聚合酶、RNA聚合酶等 ④高尔基体：多糖、核蛋白粘液生成酶 ⑤溶酶体：各种水解酶等 ⑥叶绿体：参与光合作用形成ATP、NADPH有关的酶类、与暗反应有关的酶系;线粒体主要酶的分布（约有120种酶）;2-2 起始材料的选择;2-3 细胞膜和细胞壁的破碎; 1）;; 2）;;超声波破碎法; 3）; 4）;2、选择原则; 2-4 酶的提取;2-4 酶的提取;2-5 主要的提取方法;2、酸溶液提取 在酸性条件下溶解度大并稳定的酶可用此法 如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用0.12mol/L的硫酸溶液 3、碱溶液提取 在碱性条件下溶解度大并稳定的酶该法适用 如：大肠埃希菌的L-天冬酰胺酶（pI=4.85）可用pH11-12.5的溶液; 4、有机溶剂提取：如酶与脂质结合牢固，或含有较多非极性基团的酶，可用与水混溶的有机溶剂（乙醇、丙酮、丁醇等），如： P酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶等用丁醇萃取，有较好效果 R酶：可用酸苯酚溶液提取 ; 主要的提取方法小结;5、影响酶提取的其它重要因素 温度：适当提高，可以提高酶的溶解度和酶分子的扩散速度；过高则引起酶失活 pH: 在等电点条件下，酶的溶解度最小；为提高溶解度，要避开酶的等电点;但是，也不宜偏离pI太远（过高或过低），以免引起酶变性失活 ; 提取液体积 *适当增加其体积，可以提高酶的产率 *过量，则降低[酶]，增加后续分离纯化的难度 一般为原始材料的3-5倍，且分3次使用 加入保护剂，以提高酶的稳定性 如酶的底物、辅酶和某些抗氧化剂 ; 三、酶的分离纯化（isolation,separation) ( purification); 3、基于溶解度 改变pH、离子强度、介电常数等实现的沉淀分离： (1) 盐析法 (2) 复合沉淀法 (3) 有机溶剂沉淀法 (4) 等电点沉淀法 (5) 选择性变性沉淀法;4、基于特异性结合位置/亲和力的差异 亲和色谱（层析） 5、其它方法（略） （1）基于分配系数的差异：双水相系统萃取法 （2）基于疏水作用的差异：疏水层析 （3）在磷酸钙凝胶柱上分级吸附 （4）羟基磷灰石色谱 （5）冷冻干燥（浓缩）;1、沉淀分离;取正常人血清5ml加等量生理盐水混匀 搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵使饱和度为20％　　　　↓4℃，10min 　　　离心(3000rpm), 10min，弃沉淀 上清继续滴加饱和硫酸铵使饱和度为50％ 。 　　　　 　↓置4℃，3小时以上　　　 离心(3000rpm), 10min，弃上清 所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至5ml ↓ 装入透析袋中对PBS充分透析（换液3次）　　　　　　　　　　　↓萘氏试剂测透析外液无黄色　　取少许透析袋液适当倍数稀释后，测蛋白含量。 ;2、离心（centrifugation);常速/低速离心机：主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等有形物质分离，也可分离较大颗粒的酶结晶分离； 高速离心机：最大转速1~2.5x104rpm。在酶的分离中，主要用于沉淀及细胞碎片和细胞器的分离；为防止离心过程中温度升高而致酶失活，一般用高速冷冻离心机；;;; ① 差速离心（differential centrifugation)：即采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离。 主要用于分离那些差异大的颗粒；操作简单、方便，但是分离效果较差，一般用于粗分。; 差速离心举例; ② 密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力场的作用，使样品中的组份依据其沉降速率和密度的不同而分层、分离 这类分离又分为： 差速-区带（Rate—Zonal，R-Z） 等密度（Isopyc