莲花SRAP-PCR体系的优化.doc

河南师范大学本科毕业论文 PAGE   PAGE 9 河南师范大学 本科毕业论文 莲花SRAP-PCR体系的优化 学 院 名 称： 专 业 名 称： 年 级 班 别： 姓 名： 指 导 教 师： 2010年5月 莲花SRAP-PCR体系的优化 摘要: 采用正交试验设计法对影响SRAP- PCR反应的Taq DNA 聚合酶、Mg2+和dNTPs 浓度进行了优化，同时对DNA 模板浓度进行了筛选。建立了莲花25 μl SRAP-PCR的反应体系为：Mg2+浓度为1.8 mM，Taq 酶为1.5 U，dNTPs 浓度为1.6 mM和模板DNA浓度为400 ng/μl。实验结果显示，运用优化的SRAP - PCR反应体系获得的DNA条带清晰、扩增结果稳定、多态性较丰富。 关键词：离子注入莲花突变体；SRAP- PCR 反应体系；正交设计；优化 Optimization and formation SRAP - PCR system in lotus Abstract: The system of SRAP in lotus was optimized including the concentration of Mg2+, dNTPs, TaqE and DNA template. A lotus 25 ul SRAP - PCR reaction system was established, including 1.8 mM Mg2 +, 1.5 U Taq enzyme, 1.6 mM dNTPs and 400 ng/μl DNA template. Clear, stable and abundant polymorphic bands were obtained under the optimal reaction system. Keywords: Ion implantation lotus mutation; SRAP - polymerase chain reaction (PCR) system; Orthogonal design; Optimize SRAP标记，相关系列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism)是一种新型的基于PCR的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性[1] 。该标记通过独特的引物设计对ORFs (open reading frames)进行扩增，上游引物长17bp，5’端前10个碱基为“填充”序列( filler sequence) ，无任何特异组成，接着为CCGG序列，它们组成核心序列及3＇端3个选择性碱基，对外显子进行特异扩增。下游引物长18bp，5＇端前11个碱基为“填充”序列，紧接着是AATT，它们组成核心序列及3＇端3个选择性碱基对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。该标记具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点，并已被应用于图谱构建[2]、比较基因组学[3]和遗传多样性分析[4] 。 近年来，以分子标记为重点的植物分子生物学研究迅猛发展，为研究品种之间的遗传差异提供了新的方法和手段，分子标记技术和DNA指纹分析技术已广泛应用于农作物的种质鉴定。SRAP、RAPD、ISSR、AFLP技术已被大量的运用在莲藕的遗传研究上[4-10]。 离子注入诱变育种技术是近年来发展起来的物理诱变技术。该技术以较小的生理损伤得到较高的突变率、较广的突变谱，而且具有设备简单、使用方便、成本低廉、对人体和环境无害等优点，已在棉花，烟草，水稻等方面取得成功，本实验选用经过离子注入诱变的莲花突变体，进行SRAP分子标记，从而进行莲花遗传多样性的研究，进一步确定莲花品种演化与亲缘关系。这不但具有重要的学术意义，而且对莲花的栽培、育种以及园林应用具有重要的指导意义[7]。 鉴于此，在保证扩增特异性和产量的基础上，对莲花SRAP - PCR反应体系中的Mg2 +、Taq DNA聚合酶用量，模板DNA用量和dNTP4个因子进行了优选实验，并进行了初步应用和比较，从中筛选出适宜的SRAP - PCR反应体系。为今后利用SRAP - PCR分子标记技术进行莲花遗传多样性、品种资源鉴定、进化及系统发育等方面的研究提供实验基础。 1.材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验样品 离子注入莲花突变体及其对照 1.1.2 试剂和仪器 1.1.2.1 实验试剂 变色硅