一种高效构建同源重组DNA片段的方法——.PDFVIP

3 中国生物工程杂志 　China B iotechnology, 2007, 27Ο(8) : 53～58 Ο 技术与方法 一种高效构建同源重组 DNA片段的方法 ———融合 PCR 2 2 3 李 　敏 　杨 　谦 (哈尔滨工业大学生命科学与工程系 　哈尔滨 　150001) 摘要 　融合 PCR技术 ( fusion PCR)采用具有互补末端的引物 ,形成具有重叠链的 PCR产物 ,通过 PCR产物重叠链的延伸 ,从而将不同来源的任意 DNA 片段连接起来 ,此技术在不需要内切酶消 化和连接酶处理的条件下实现 DNA片段的体外连接 ,为同源重???片段的构建提供了快速简捷的 途径。对原有的融合 PCR技术进行改进 ,以 3个同源重组线性 DNA 片段的构建为例 ,详细论述 了改进的融合 PCR技术的反应过程及技术体系。结果表明 ,改进的融合 PCR技术可以同时进行 3个片段及 4个片段的融合反应 ,产物长度均在 4. 5kb以上 ,各同源重组片段在扩增过程中均无 突变发生 ,获得的片段可以用于后续实验分析。 关键词 　融合 PCR　重组片段 　同源臂 　抗性基因 中图分类号 　Q784 　　随着大规模的基因组测序计划的完成及大量表达 不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下 ,采用具有 序列标签数据库 ( dbEST)的建立 ,基因组研究已由结构 互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来 ,为 基因组逐渐转向了功能基因组研究 [ 1 ] 。以同源重组技 同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。现有的 术为基础 ,通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体 融合 PCR技术一般包括两步 PCR 反应 : ( 1)应用特异 并取代基因组中野生型的等位基因 ,进而研究目的基 性引物 ,对各片段进行独立扩增 ,特异性引物的 5′末端 因与表型性状间的关系 ,是研究动物、植物、微生物基 带有一段相邻片段的互补序列 ; (2)在同一反应体系中 因功能的一种非常有用的遗传操作方法 [ 2～4 ] 。 加入各片段的混合物 ,以一对外侧引物进行融合片段 　　同源重组的发生依赖于载体与目的片段间存在一 的全长扩增。由于融合 PCR 技术正处于初步发展阶 定的 DNA 序列同源片段 ,同源片段越长越有利于同源 段 ,在应用过程中还存在很多方面的问题 ,如融合产物 重组事件的发生。传统的同源重组载体的构建以限制 长度一般在 4. 0kb 以下、待融合片段的个数一般