常用生物化学检验技术.ppt.ppt

常用生物化学检验技术; 光谱分析技术是根据物质吸收或发射辐射能而建立起来的一类分析方法，因不同分子的原子和原子团，其发射光谱和吸收光谱不同，而相同的物质在一定条件下，其发射光谱和吸收光谱的强度与该物质的含量成正比关系。因此可对物质进行定性和定量分析，此类技术称为光谱分析技术。; 光谱分析技术是一种最常用的生化检验技术，它主要包括： 吸收光谱分析：可见、紫外、红外分光光度法和原子吸收分光光度法 散射光谱分析：散射比浊法和透射比浊法 发射光谱分析：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法 ; 光是一种高速传播的电磁波，光的波长（λ）的常用单位是纳米（nm），可见光波长400～760nm，＜400nm称为紫外光，＞760nm称为红外光，波长愈短，能量愈大。 可见、紫外吸收光谱是由于多原子分子的价电子在电磁辐射的作用下，由基态跃迁到激发态，这种因物质分子对辐射能的选择性吸收而得到的光谱称为吸收光谱。; 吸收光谱分析法包括可见、紫外、红外和原子吸收分析法。其中最常用的是可见光分析法，也被不严格地称为比色分析法，准确的名称应是可见光分光光度法。 用于比色分析的光源与被测溶液的颜色应为互补色。; 可见、紫外吸收光谱用于定量分析的依据是光吸收定律，即Lambert-Beer定律，它是吸收光谱法的基本定律。; 一、Lambert-Beer定律 1. Lambert定律 当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，则透过的光线为It。当溶液浓度不变时，透过的液层愈厚，则光线强度的减弱愈显著。; 用数学式表示为： 透光度随溶液厚度增加而减少，其关系是透光度的负对数（－lgT，吸光度A）与溶液厚度成正比，即; 2. Beer定律 当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后，若液层厚度不变，而浓度不同时，溶液的浓度愈大，则透过光的强度愈弱，其定量关系A=K·C。 当液层厚度不变时，吸光度与溶液浓度成正比，这就是Beer定律。; 3. Lambert-Beer定律 合并Lambert定律与Beer定律可得 A=K·L·C 说明吸光物质对单色光吸收的强度与物质的浓度和液层厚度成正比。 吸光系数K的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度，在给定条件下（波长、溶液性质、浓度）吸光系数是物质的特征常数，K值愈大，能测定的浓度C愈小，则灵敏度愈高。; 二、比色分析仪器 即可见光分光光度计，各类分光光度计的结构和原理基本相同，一般包括光源、单色器、吸收池、检测器和显色器五大部分。 1. 光源 可见光常用钨灯，现用卤钨灯；紫外光常用氢灯。 2. 单色器 可用滤光片、棱镜、光栅。 3. 吸收池 (比色杯) 4. 检测器 光电管或光电倍增管 5. 显示器 指针式或数字式; 三、比色分析的特点 1. 灵敏度高 被测定物质的最低浓度一般为10－5～10－6mol/L。 2. 测定快速、简便。 3. 应用范围广 一些无色物质在一定条件下与显色剂反应，可生成有色物质。;四、比色分析的定量方法 （一）对比法 又称标准对比法，通常在测定未知浓度样品的同时，测定一已知浓度的标准液作比较，然后分别测定两者的吸光度。 AS=KLSCS AR=KLRCR; 因测定成分相同，故K值相同，比色时用同样规格的比色皿故LS=LR，所以比色分析中测定标准液与未知液吸光度的比值也就等于其浓度的比值，即 若标准液与样品用量不等时，则再乘 。 用对比法进行定量时，为了减少误差，选用标准液浓度应尽可能接近待测样品浓度。; （二）标准曲线法 配制一系列浓度不同的标准液，按一定操作方法显色后，用选定的波长分别测定它们的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，标准液浓度为横坐标，在坐标纸上标出各坐标点，通过连接各点，使其成一直线，即A-C曲线。;·; 注意事项 1. 测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。 2. 标准品