催化羟基化反应的影响.PDFVIP

微生物学通报 Mar. 20, 2017, 44(3): 505?512 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.151064 研究报告 α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其 催化羟基化反应的影响 文方 1 聂尧 1* 穆晓清 1 徐岩 1,2 (1. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122) (2. 江南大学 食品生物技术国家重点实验室 江苏 无锡 214122) 摘 要：【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) L-异亮氨酸双加氧酶 (L-isoleucine dioxygenase，IDO)为研究对象，考察其催化 L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响 因素，构建 IDO 催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过 Ni-NTA 亲和层析法从重组大 肠杆菌(Escherichia coli) BL21/pET28a-ido 中纯化获得重组 IDO，以 L-Ile 为底物，考察重组 IDO 催化羟基化反应的影响因素，并进一步针对耦联反应优化 α-酮戊二酸(α-KG)在重组 IDO 酶促 转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组 IDO 催化 L-Ile 羟基化的活性测定，计算该酶 Km 为 ?1 0.247 mmol/L，kcat 为 1.260 s ，kcat/Km 为 5.101 L/(mmol·s)，与其他同源酶动力学参数比较分析 表明，重组 IDO 的底物亲和性及催化效率较高。重组 IDO 催化反应的最适温度为 20 °C、最适 pH 为 7.0；在 35 °C 以下较为稳定；反应体系中 Fe2+最适浓度为 1 mmol/L。重 组 IDO 可催化不 同 L-氨基酸反应，对 L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化 α-KG 浓度， 反应体系中添加 30 mmol/L α-KG 时，可将底物浓度提高至 70 mmol/L，产物 4-羟基异亮氨酸 (4-HIL)的摩尔产率达 66.20%，表明 α-KG 作为反应耦联辅因子，其浓度对重组 IDO 催化 L-Ile 羟基化具有显著影响。【结论】重组