松材线虫实时PCR检测方法的建立.PDF

1 1 1 技 术 开 发 　 松材线虫实时 PCR检测方法的建立 陈凤毛 ,李玉琴 ,叶建仁 (南京林业大学 ,江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室 ,南京 210037) 摘 　要 :对南京林业大学开发的松材线虫实时 PCR检测方法的操作过程进行了规范化 。介绍了检测松材线虫所 需要的试剂及使用方法 ,对仪器的稳定性进行了验证 ,对检测结果的判读方法进行了规定。规范化的检测方法灵 敏度高 ,特异性强 ,应用方便 。 关键词 :松材线虫 ;实时 PCR2;检测方法 　　松材线虫病 ( Pine wilt disease)是一种危险性极 1. 2 　试 　剂 高的病原主导性病害 。自 1982年我国在江苏首次发 松材线虫实时 PCR 检测试剂盒 (南京林业大学 现以来 , 该病已对我国江苏、浙江 、安徽等多个省 森林保护研究所研制 )组成成分如下 : (市 )的松林造成了严重危害。止 2006年底 ,每年发 (1) DNA提取试剂 (A液、B液 ) ; (2) TaqMan PCR 生面积约 10万 hm2 ,累计枯死松树 5 000万株 ,直接 Master M ix ( K 液 ) ; ( 3 ) TaqMan 探 针 ( L 液 ) , [ 1 ] 2 经济损失约 42亿元 。对我国南方 3 400万 hm 松 10μmol/L; (4)正向引物与负向引物 (M 液 ) , 10μmol/ 林以及一批世界著名风景名胜区 、自然文化遗产与重 L; (5)灭菌双蒸水 (C液 ) ; (6)阳性对照 (Y液 )。 点生态区的安全构成了严重威胁 。因此 ,该病是目前 该引物与探针具有很强的特异性以及非常高的 我国林业上最具危险性的检疫性病害。 灵敏度 [ 2 ] 。 分析我国松材线虫病疫情发生特点 ,病害流行大 1. 3 　试验用线虫 多由人为传播染病疫木引起 。染病疫木及其制品在 试验线虫为一株松材线虫 ,来源于南京林业大学 我国能够大量扩散 ,从技术层面看 ,主要是一直以来 线虫基因资源库 。 在国内外都缺乏快速 、准确 、有效 、简便易行的松材线 1. 4 　试验方案 虫检疫检验和鉴定技术 ,使得我国大多数针对松材线 (1)分别用 1、2、3、4、5、10、15、30条松材线虫进 虫病的检疫工作往往只能流于形式 ,在监测过程中 , 行试验 ,以纯水作阴性对照 (CK) ,以便确定样品检测 往往不能及时发现和确定疫情。针对这一技术难题 , 时的判读范围。 南京林业大学已开发出一系列松材线虫分子检测技 (2)将试剂盒中阳性对照 (松材线虫 DNA )依次 术 ,并已通过江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。本 稀释 10、102 、103 、104 倍 ,以便检测仪器的可靠性。 文主要对其中的松材线虫实时 PCR检测操作方法进 1. 5 　未知样品检测 行了规