分离尿激酶的亲和色谱填料制备.PDFVIP

分离尿激酶的亲和色谱填料制备* 高俊萍 梁峰 常建华** （西北大学化学系 西安 710069 ） 郭立安 苏天升 （第四军医大学中心实验室 西安 710032） （中国科学院北京化学研究所 北京 100080） 提 要 本文合成了以 Sepharose 和聚甲基丙烯酸环氧丙酯为基质，对氨基苯甲脒为配基的 分离尿激酶的两种亲和色谱填料，并应用于尿激酶粗品的直接纯化中，活性回收率分别为 108.3%和 43.4%，比活提高倍数分别为 9.06 倍和 36.9 倍。 关键词 亲和色谱 填料 分离 尿激酶 1 前言 亲和色谱是利用其不溶性载体上的特殊配体对与其具有特异性亲和作用的生物大分子 进行分离纯化的色谱方法[1]。由于这种方法选择性好，活性回收率高，已广泛应用于生物大 分子的分离制备、生物认知[2]、药物分析[3]、食品分析[4]及生化分析[5]等各个领域，在生化 制药及生物工程下游得到广泛应用。 尿激酶是一种蛋白水解酶[6]，存在于哺乳动物的血液中[7]，能活化血纤维溶酶原成为血 纤维溶酶蛋白，对血栓病有特殊疗效，具有很高的经济价值。而直接从尿液中提取的尿激酶 粗品必须经过进一步分离纯化才能应用于临床制药。 目前分离尿激酶粗品的主要方法有离子交换色谱法[8]、疏水色谱法[7]和亲和色谱法。前 两者用于初步的纯化，而使用亲和色谱法作进一步纯化具有明显优势。文献报道，在 Sepharose 和聚甲基丙烯酸基球上键合对氨基苯脒可用来分离尿激酶[9]。文献上报道的纯化 试剂是尿激酶针剂，为了寻找能用于尿激酶粗品的分离的亲和色谱填料，研究亲和配体的结 构为对尿激酶的作用，探求一种高效而价廉的合成工艺，我们对不同基球、不同配体及不同 合成工艺的亲和色谱填料进行了研究。 本文采用 Sepharose 和聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球作基质，对氨基苯甲脒作配体，采用 新的合成方法制成填料，并应用于尿激酶粗品的分离纯化，取得了较为满意的效果。 2．实验部分 2．1 试剂和仪器 Sepharose —4B （pharmacia 公司）, 环氧氯丙烷（西安化学试剂厂，化学纯）, 氨 基己酸 （上海试剂三厂，生化试剂）, 1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（简 写 EDC.HCl, 中科院上海生化所）, 对氨基苯甲脒盐酸盐（简写 p—ABZ 盐酸盐,进口分装）， 聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球（中科院北京化学所提供），二环己基碳二亚胺（简写 DCC）， 其他试剂皆为分析纯。 WZ—90—1 型紫外检测仪（上塘教学仪器厂），BT01—100 型蠕动泵 （保定蓝格公司） ， TU - 1201 紫外分光光度计（北京通用仪器公司）。 2.2 填料的合成 2．2．1 填料 A 的合成 30ml Sepharose—4B 凝胶用水充分洗涤后，加入 30 ml 2mol /L NaOH 和 3ml 环 氧氯 丙烷,110mgNaBH4，室温下搅拌 2h。在此期间缓慢滴加 15ml 2mol/L NaOH 和 9ml 环氧氯 丙烷 ，放置过夜。产物用水—20%乙醇—水依次洗涤。 取上述产品 5 ml 加入氨基己酸 5 g，2 mol/L 的碳酸盐缓冲溶液（pH=10.5）30ml,60—650C 反应 16h,放置过夜，过滤出产品，依次用水—10%乙醇—水洗。 上述产品加入 45 ml 水，300mg p—ABZ，调 pH=4.5,加入 0.8g 1-乙基-3-（3-二甲基氨丙 基）碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCl）。室温下搅拌 24 小时，过滤，洗涤，得产品。 *陕西省教委重点科研项目资助,项目批准号：96JZK15 **通讯联系人 合成反应如下：