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浙江**药业股份有限公司 SOP-QC-*** ***内毒素标准操作规程 1. 目 的：建立样品中细菌内毒素检查方法标准操作规程，规范操作。 2. 适用范围：化验室 3. 有关责任：化验室化验员对本规程的实施负责，化验室主任对本规程的有效执行承担监督检查责任。 4. 程 序： 本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断样品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素的量用内毒素单位EU表示。 4.1试验材料及工具 分析天平 电热干燥箱（250℃） 恒温培养箱型号 旋涡混合器 微量移液器 200～1000μl 50～200μl 无热源吸头 大号、小号、试管架、封口膜 鲎试剂 （应具有国家主管部门的批准文号，我公司常用湛江安度斯） 细菌内毒素检查用水（BET水） 细菌内毒素工作标准品 无热源的小试管10×75mm或无热源安瓿 无热源的小试管15×100mm及无热源的药匙 操作方法 实验准备 将所有玻璃器皿及药匙用洗液（包括三效灭活剂）浸泡4小时以上，用清水及纯化水冲洗后，置250℃电热干燥箱中干热灭菌30分钟以上。试验过程中应防止微生物的污染。 4.2.2供试品溶液制备 精密称定样品20mg于无热源的15×100mm小试管中，加混合液（280mg 96%乙醇溶液+650mg 聚氧乙烯蓖麻油）2ml，置自动旋涡混合器中30秒使样品溶解后，再用BET水稀释成1mg/ml样品原液（C），置自动旋涡混合器中混和30秒。 根据L值（限值），确定样品的最大有效稀释倍数（MVD）： MVD= c L / λ 式中： L 为供试品的细菌内毒素限值； c 为供试品溶液浓度； λ 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml). 例：L值为2EU/mg，鲎试剂的灵敏度λ为0.125EU/ml。 2EU/mg·C 2EU/mg×1mg/ml MVD= = = 16倍 λ 0.125EU/ml 吸取样品原液（浓度为1mg/ml）按如下表1稀释制得供试品溶液： 表1 L值MVD原液体积加BET水量 （=总体积－吸原液体积）供试品溶液 总体积2 EU/g160.1 ml1.5 ml1.6 ml 4.2.2 内毒素工作标准溶液的制备 根据鲎试剂灵敏度的标示值，取细菌内毒素工作标准品一支，加入1ml BET水，用??口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟，然后制成所需浓度的细菌内毒素标准溶液（2λ）每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。 例：细菌内毒素工作标准品为50EU/支，加BET水1ml即50EU/ml，如鲎试剂灵敏度为0.125λ，那么细菌内毒素标准溶液应当为2×0.125λ=0.25λ 即0.25EU/ml。 应按以下方式进行稀释： 0.3ml 0.5ml 1ml 1ml 1ml 50EU/ml 5EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 2.7ml 2.0ml 1ml 1ml 1ml 4λ 2λ λ 4.2.4 凝胶限度试验 在制备内毒素工作标准溶液的同时，取鲎试剂8支，按表2制备溶液A、B、C、D。 编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数备注A无/供试品溶液2供试品溶液B2λ/供试品溶液2供试品溶液阳性对照C2λ/ BET水2阳性对照D无/ BET水2阴性对照A: 鲎试剂加0.1mlBET水复溶，再加入0.1ml供试品溶液，为供试品管； B: 鲎试剂加入0.1ml供试品溶液复溶，再加2λ内毒素标准溶液，为供试品阳性对照管，即（PPC管）； C: 鲎试剂加0.1mlBET水复溶，再加入0.1ml 内毒素标准溶液，为阳性对照管； D: 鲎试剂加0.1mlBET水复溶，再加入0.1ml BET水，为阴性对照管。 加样结束后，封口，放入37±1℃的恒温装置内保温60±2分钟后观察结果。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性