基因分子生物学实验报告第一次实验报告.docVIP

基 因 分 子 生 物 学 实 验 报 告 实验名称： RNA的制备、鉴定及RT-PCR 实验类型： 验证型□ 综合型√ 设计型□ 实验室名称： 分子细胞遗传实验室 指导教师：____________王欣______________________ 班级： 周二 组别： 3 姓名： 姜仁涛 学号： S2011008044 成绩： 实验起始日期： 2012-2-28 基因分子生物学实验  PAGE \* MERGEFORMAT 1 一．仪器设备型号 SIGMA高速冷冻离心机2K15 SANYO制冰机SIM-T-124 高压消毒锅YX-280 Biometra PCR仪T-1 恒温水浴箱 通达涡旋振荡仪TDX-1 Tanno凝胶成像仪Gis-2010 一恒恒温干燥箱DHG-9070A DYY-6C型电泳仪 Eppendorf生物分光光度计AG22331 二. 实验材料 HEK293细胞 Trizol试剂 氯仿 异丙醇 无Rnase水 75%乙醇（???水乙醇75ml，DEPC水或高压灭菌双蒸水25ml） 10*上样缓冲液（聚蔗糖2.5g或40%聚蔗糖：5ml，溴酚蓝25mg，二甲苯青25mg，0.5M EDTA 20ul，DEPC水10ml） 10mg/ml EB（EB 0.1g，DEPC水10ml） 琼脂糖 1*TAE GAPDH上下游引物 TRANSTM第一链cDNA合成试剂盒（EasyScriptRT/RI Enzyme Mix，2*ES Reaction Mix，Random Primer，Anchored Oligo（dT）18 Primer，Rnase-free water） 三．实验方法 RNA提取 1）观察培养细胞，10cm平板内约80%密度，生长良好；吸尽培养液后，立即将Trizol直接加入培养板中裂解细胞，不断摇动。每10cm2面积加入1mlTrizol。用一次性针管，吹吸几次，转移到一EP管中，室温静置5分钟。 2）加0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置3分钟。12 000rpm 4℃离心15分钟。 3）将上层水相转移到另一EP管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温静置20-30分钟；10 000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。 4）加入1ml75%乙醇（DEPC处理的水配制），剧烈涡旋洗涤沉淀（将沉淀击碎），6000rpm 4℃离心5分钟，弃上清，室温晾干沉淀（大约5分钟左右）。 5）RNA的溶解：用100ul无Rnase水溶解沉淀。55-60℃孵育10分钟，分装样品，（30,30，40ul），其中一管30ul做RNA电泳。另两管待用。 6）取1ulRNA溶液，稀释至100ul。测RNA浓度、260nm/280nm、260nm/230nm。 RNA琼脂糖电泳 配胶：琼脂糖1g，1*TAE 100ml 微波加热融化，冷却至60℃，灌胶。 电泳，向水平电泳槽中加入1*TAE至恰好浸没凝胶1mm左右，每孔加入10~20ul样品，100V电泳15分钟，紫外灯下观察RNA分离情况，比较28S rRNA和18S rRNA的含量。 RT-PCR 1)反转录合成cDNA： 取一支0.2ml EP管加入 Components Volume（ul） Total RNA 2(50ng~5ug) Random Primer（N9）（0.1ug/ul） 1 2*ES Reaction Mix 10 EasyScriptRT/RI Enzyme Mix 1 Rnase-free Water to 20 轻轻混匀 25℃孵育10分钟，42℃孵育50分钟 70℃加热15分钟失活EasyScriptRT。 2）RT-PCR 取1/10~1/5(2~4ul)的反转录产物作为PCR模板； 条件（以25ul反应体系为例）： Co