第3章核酸的分离与检测.pptVIP

Chapter 3 Separate and investigate target gene;从哪儿提取（Where）？ 怎么提取（How）？ 提到什么程度（What）？ 会出现什么问题（Questions）？如何解决（Solution）？;主要内容;核酸提取的原则和基本要求;Principle and steps ;核酸提取的一般过程;Principle and steps ;破碎细胞-方法;破碎细胞-来源;破碎细胞（来源-方法）;抽提核酸除去杂质;核酸的纯化;核酸样品的保存;关键试剂的作用;关键试剂的作用;关键试剂的作用;关键试剂的作用;关键试剂的作用;关键试剂的作用;核酸的部分特征;核酸的部分特征;1.存在形式;2.pH值的影响;3.盐影响;4.温度影响;核酸的常用提取方法;常用的DNA提取方法;1. 浓盐法;1. 浓盐法;2. 阴离子去污剂法;3. 苯酚抽提法;4. 水抽提法;5. 沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）;5. 沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）;6. 碱变性法;核酸提取的经典案例;主要案例;6. 碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA） ;6. 碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA） ;6. 碱变性法-试剂;溶液Ⅰ--溶菌液;溶液Ⅰ--溶菌液;溶液Ⅱ--NaOH-SDS液 ;溶液Ⅱ--NaOH-SDS液 ;溶液Ⅲ--3MOL/L?NaAc(pH4.8)溶液;大肠杆菌染色体DNA的抽提 ;大肠杆菌染色体DNA的抽提 ;CTAB法提取植物基因组DNA ;;实验程序;实验程序;核酸提取的注意事项;注意事项;注意事项（细胞破碎）;注意事项（分离与纯化）;注意事项（沉淀、溶解）;核酸提取的常见问题与对策;常见问题与对策;问题与对策;问题与对策;核酸提取的相关说明;为什么用无水乙醇沉淀DNA? 在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么加NaAC或NaCL? 加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再用SDS与KAc来处理? 为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？ 如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA? 抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好? 为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇? 为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?;为什么用无水乙醇沉淀DNA?;在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么要加NaAC或NaCL;加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理? ;为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？;如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?;抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?;在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%-15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用。 （利用氯仿除酚）;为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?;为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?;1. 传统的分离方法是用oligo (dT)-纤维素柱分离mRNA;用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图;Chapter 3-2 How to assay NA;Methods;分光光度法;二苯胺法测定DNA含量 ;定磷法测定DNA; 在过量（NH4）2?12MoO4存在时，黄色沉淀溶解于过量的磷钼酸盐溶液中。当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再与试剂中其他的MoO42-结合成Mo（MoO4）2或Mo3O8，呈蓝色。该产物在660nm处有最大的光密度峰，其峰值与光密度成正比。求得单位体积的含磷量除以9.0%既可得单位体积RNA的量，或除以9.2%则为DNA的含量（测DNA时）。核酸制品中微量的无机磷，非核酸的??机磷、硅酸盐、铁离子以及酸度过高或偏低都会影响定磷法的测定结果；但其灵敏度高，最低可测到核酸10μg/ml的水平，准确性较好。 ;电泳检测法;迁移率与下列因素有关：;电泳检测法;凝胶电泳，DNA移动距离和分子量关系（缓冲液0.5×TBE,0.5ug/ml 溴化乙锭电泳条件1v/cm 16小时） ;;迁移率与电泳条件的关系;迁移率与琼脂糖浓度的关系;迁移率与琼脂糖浓度的关系;材料;缓冲溶液配制表;;实验步骤;实验步骤;;【注意事项】;;基因工程：第三章;基因工程：第三章