现代基因工程_01基因克隆和DNA分析选编.pptVIP

基因工程第一讲基因克隆和DNA分析;讲课提纲;1.1 遗传学的早期发展;直到20世纪40年代，人们仍然没有认识到基因的分子本质。人们普遍认为基因是由蛋白质构成的。 遗传学的第二个高峰：1952—1966年 DNA的结构被精确地表述， 遗传密码被破解， 转录和翻译的过程也得到了描述。;经过一段时间的活跃发展之后，遗传学迎来了一个平静的发展时期。 实际上，在当时20世纪60年代的后几年，实验技术的精确性不足以满足对基因的更加细致的研究，这成为了当时遗传学发展的最大“瓶颈”。;1.2 基因克隆和聚合酶链反应(PCR)的出现;基因工程发展出—DNA测序技术： 使个体基因的结构确定成为可能 基因工程发展出个体基因调控的方法 了解到基因调控的失常将有可能导致一系列的 人体疾病，如癌症。 由重组DNA技术衍生出了生物工程学(biotechnology)：使利用基因生产蛋白质及其他医药和工业过程所需的化合物变成了现实。;20世纪80年代，Kary Mullis发明了聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR) 结果：这项非常简单的技术，作为基因克隆的完美补充，在分子生物学的发展上发挥了关键的作用。 PCR相对于许多传统的基因克隆方法，把可能实现但相当困难的实验变得相对简单。 意义：拓展了DNA分析的研究范围， 不仅应用于传统领域：医学、农业、生物工程学 也应用于新兴领域：分子生态学、 DNA法医学、生物分子考古学 很多新兴学科随着PCR的诞生而出现;1.3 什么是基因克隆;;1.4 什么是PCR;(1) 加热到94℃：DNA双螺旋氢键被打破，DNA变性。 (2) 冷却到50-60℃：引物与长链DNA分子发生退火。 (3) 又被升高到74℃：Taq DNA聚合酶最适工作温度，合成与模板DNA互补的新链。 (4)接下来开始第二轮变性—退火—合成的循环。 在重复这一循环达25次后，我们在反应开始时用到的双链DNA分子将变成超过5千万的新的双链分子。;1.5 为什么基因克隆和PCR如此重要;1.5.1 通过克隆对基因进行分离;决定基因克隆试验是否成功的关键： 能否从最初得到的许多不同基因中鉴别出感兴趣的特定基因。 比如，当拿到一个包含有4 000多个基因的大肠杆菌基因组的时候，我们也许就会对如何从这么多可能的克隆中找到一个基因感到困扰(图1-4)。 在以后将要解释，通过各种措施，能够确保获得正确的基因克隆。;一旦一个基因被克隆出来，就可以几乎不受限制地得到关于这个基因结构和功能方面的相关信息。 克隆产品在运用中使用到的一系列新的实验技术也刺激了基因研究分析方法学的进步。 关于研究克隆基因产物的结构和功能的方法将以后分别进行介绍。;1.5.2 通过PCR对基因进行分离;PCR可以在几小时内完成，基因克隆要一周或更长时间，为什么基因克隆仍然被人们使用? PCR的两个局限性： (1)为了使引物能够在正确的位置与模板DNA实现退火，必须清楚目的基因两端的序列。 已知序列情况下，合成引物容易； 如果序列不清楚，无法制造出合适的引物。 即，PCR不可能分离从未进行过研究的基因， 而基因克隆技术可以。;(2)PCR扩增的DNA序列在长度上受到一定的限制。 5kb的片段能够顺利复制， 40kb的片段需要采用特殊的技术处理。 40kb对于许多基因来说还是太短了，尤其是人类和其他哺乳类动物的一些基因。 如果需要的是一个长基因的完整拷贝，就必须使用基因克隆技术。 因此，基因克隆是分离长的或从未进行过研究的基因的惟一方法。;PCR仍然有许多重要的应用： 比较基因组学的方法分离具有相同作用的基因 对已知序列的基因进行分离和探测 如，人体球蛋白基因的PCR，可被用来检测可能导致地中海贫血的基因突变。 因为人类球蛋白的基因是序列已知并得到充分研究，为这个PCR设计适当的引物是一件很简单的事。 PCR完成后，就可以利用其他方法对基因拷贝进行测序或进一步研究，以判断是否存在导致地中海贫血的基因突变。;PCR灵敏度极高：经过仔细建立的反应能够获得可检测量的DNA，即便在最初的样本中只有一个需要扩增的DNA分子。 PCR的临床应用： 致病病毒DNA的检测 PCR阳性结果可以显示出某个样品包含该病毒，提供该样品的人在经历一定治疗后能够防止疾病的发作。 即，PCR能够在病毒感染的最初阶段就将其检测出来，增加了治愈此疾病的机会。 PCR也能够用于扩增法医鉴定时涉及的DNA。;;蓝白斑 筛选;附： M13-纤维状噬菌体;;;;当细菌分裂时每个子细胞都得到一个或多个噬菌体基因组的