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标准化操作程序 一、标本接收筛选方案： 目测：黄色、灰色、血性、铁锈色，浑浊、 稠厚，呈现团块状的标本为合格标本； 而无色透明、有灰白片状物或黑色小点，有明显食物渣滓、纸屑灰尘的为不合格标本。 显微镜下筛选：对经过目测筛选的标本，在洗涤前还须再经过显微镜下筛选：取约 0.1ml痰液（黄豆大小）用接种环均匀涂布成2×2cm2大小的涂膜，在显微镜下，凡脓细胞25/LP且鳞状上皮10/LP的标本为合格标本，可进入下一步程序；而脓细胞10/LP但细菌数量+++或鳞状上皮25/LP的标本为不合格标本，应拒收。 1、标本预处理：采用先用20ml生理盐水洗涤两次，经过10ml生理盐水稀释后，加入1%的PH7.6的胰蛋白酶溶液消化90min后接种。并同时在洗涤后制作原始痰涂片，进行染色镜检。 读片：根据人体对细菌/真菌感染在早期主要以非特异性免疫的细胞免疫为主的特点，结合呼吸系统生理病理特点，阐述痰液形成过程和排出过程，我们可以得知，在下呼吸道中感染中形成的炎性渗出、包裹物中存在与感染直接相关的病原菌，在自然排痰的过程中会被上呼吸道的正常菌群所污染，但污染菌位于炎性包裹物之外，且人体对正常菌群具有共生性保护因而不会产生吞噬现象，借此理论，我们将选择痰标本中脓细胞成团块状分布，集中而不稠密，且周围无鳞状上皮细胞或无大量成团状分布的细菌球的区域为读片区，认真收寻20~30个视野中脓细胞聚集处的脓细胞胞浆中有无吞噬的细菌及细菌的染色排列特征，菌体特征（如粗细、长短、扭曲）并作记录，将此作为确定病原菌的理论依据。 二、标本的接种培养：一般情况接种BA、Choc（含万古霉素50mg/L）、麦康凯/MecK(即“分科琼脂”NBIIA)、CHROMagar，BA、Choc置5%CO2、35℃潮湿环境培养，麦康凯/MecK、CHROMagar置普通环境35℃培养；怀疑为军团菌的加种BCYE-а培养基，怀疑为百日咳的加种Boudet-Gengou培养基，怀疑为肺结核的加种罗-琼氏培养基或采用商品化专门的分枝杆菌培养基培养；怀疑为肺炎支原体感染的加种Hayflick双相培养基或采用免疫学及分子生物学方法检测，肺炎衣原体须用免疫学或分子生物学方法。 三、读碟：（经过18~24h隔夜培养，但孪生球菌、营养缺陷链球菌以及分枝杆菌则需延长培养时间）  1、G+菌：BA生长、Choc不生长、MecK不生长，革兰染色：分G+co（革兰阳性球菌） ,G+ b（革兰阳性杆菌）  ①G+co—依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形态区分: 葡萄球菌：淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则圆形，β/γ溶血，较湿润，除金黄色葡萄球菌外，一般不具有临床意义； 微球菌：黄色/白色/橙色，中等大小，较凸，规则圆形，不溶血，较干燥，不易乳化较葡萄球菌生长缓慢，该菌一般无临床意义； 链球菌：白色/灰白色、凸起小菌落，β溶血为溶血型链球菌；灰白隆起中心扁平或凹陷，1.0-1.5mm大小的宽大а溶血为肺炎链球菌，该菌是最常见的肺部感染病原菌，在社区获得性感染中有重要的地位；细如针尖，白色凸起а溶血的为草绿色链球菌，自然咯痰标本中的草绿色链球菌一般不具有临床意义； 肠球菌：灰白，低凸，2.0mm左右之а溶血菌落，较湿润，但一般不具有临床意义； 口腔球菌：白色凸起较大菌落，不溶血，黏着，接种针挑之则整个菌落挑起，琼脂上不留痕迹。该菌偶尔可引起肺部的严重感染，一般好发生于COPD病人和肺气肿病人； 孪生球菌：白色、凸起细小菌落，β溶血，生长慢48h仅0.2~0.4mm，在含羊血的MH琼脂上不生长。该菌是上呼吸道的正常菌群组成之一，一般不导致肺部感染； ②G+ b—依靠溶血特征，菌落形态、菌落大小、菌体形态区分： 棒状杆菌：白色1.0-1.5mm左右大小，较干燥，不溶血/狭窄β溶血的为白喉或一般棒状杆菌；小而湿润，灰白/无色，半透明的为J-K棒状杆菌；灰白细小，β溶血的可能为假结核、化脓放线菌、溶血分泌杆菌；除白喉杆菌外，假结核、化脓放线菌、溶血分泌杆菌是罕见的咽喉部病源菌，棒状杆菌一般不导致肺部感染； 乳杆菌：细小，白色凸起а溶血菌落，有特殊的酸臭味，口腔正常菌群，无临床意义； 芽孢杆菌：灰白大菌落，表面粗糙如毛玻璃状、蜡状、边缘不规则，不同种类菌落形态差异巨大，宽大β溶血。延长培养时间，菌落从湿润变得干燥，边缘呈放射状扩散，形成叶状、掌状、雪花状、齿轮状等，常常为痰培养的污染菌； ③BA生长、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：G+co 平面球菌、藻球菌：血琼脂上为а溶血，0.5-1.0mm大小，在Choc上呈现金属色泽，无临床意义。