生物化学实验2实验报告.docVIP

吉林大学国家级生物实验教学示范中心实验报告 姓名：李勍动课程:生物化学实验 = 2 \* ROMAN \* MERGEFORMAT II题目：动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定学号：时间：2012.11.24成绩：教师签字： 共 页，第 页 一、实验目的 1、学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术； 2、了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点； 3、学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法； 4、熟悉离心机、分光光度计等仪器的使用方法。 二、实验原理 （一）背景知识 核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，参与蛋白质合成、基因表达与细胞功能调节。 核酸种类：DNA—线型双链、环状双链、线型单链、环状单链。 RNA—rRNA、tRNA、mRNA。 核酸的分布：细胞核、线粒体、叶绿体、核糖体、游离。 （二）核酸的理化性质　 1、粘度 大分子溶液比普通溶液粘度大，线形大分子又比球形大分子粘度大。DNA是线形大分子，人类二倍体DNA总量3.3×109bp，全长可达1.75米，DNA分子平均长度在4cm以上，而双螺旋直径只有2nm，长度与直径之比高达107。因此，DNA粘度极高，也极易在机械力作用下折断。双链DNA解链成为单链DNA时，由较伸展的双螺旋变成较紧凑的线团结构，粘度明显下降。RNA因为分子量小，且呈线团结构，所以其粘度低得多。 2、密度 利用密度梯度离心可以测定大分子的浮力密度。CsCl溶解度大，可制成8M溶液。DNA的浮力密度一般在1.7以上，RNA为1.6，蛋白质为1.35-1.40。分子量相同结构不同的DNA沉降系数不同，线形双螺旋DNA、线形单链DNA、超螺旋DNA沉降系数之比为1:1.14:1.4。因此通过测定沉降系数可以了解DNA的结构及其变化。 3、紫外吸收 嘌呤和嘧啶因其共轭体系而有强紫外吸收。核酸在260nm有紫外吸收峰，蛋白质在280nm。利用紫外吸收可测定核酸的浓度和纯度。一般测定OD260/OD280，DNA=1.8，RNA=2.0。如果含有蛋白质杂质，比值明显下降。不纯的核酸不能用紫外吸收法测定浓度。紫外吸收改变是DNA结构变化的标志，当双链DNA解链时碱基外露增加，紫外吸收明显增加，称为增色效应。双链、单链DNA与核苷酸的紫外吸收之比是1:1.37:1.6。 4、DNA的变性 在一定条件下，双链DNA解链变成单链DNA的现象称为变性或熔化。加热引起的变性称为热变性；碱性条件（pH11.3）下，DNA发生碱变性。此外，尿素、有机溶剂、甚至脱盐都可引起DNA变性。除去变性因素后，互补的单链DNA又可以重新结合为双链DNA，称为复性或退火。DNA复性由局部序列配对形成双链核心的慢速成核反应开始，然后经过快速的所谓拉链反应而完成。 DNA变性后粘度降低，密度和吸光度升高。 （三）核酸分离、纯化原则 在生物体中核酸以结合成核蛋白(DNP/RNP)的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。核酸的基本分离原则如下： ① 保持核酸分子一级结构的完整性； ② 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染； ③ 无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应去除RNA分子）。 注意：  = 1 \* GB3 \* MERGEFORMAT ①在低温下进行操作；  = 2 \* GB3 \* MERGEFORMAT ②减少物理因素对核酸的机械剪切力；  = 3 \* GB3 \* MERGEFORMAT ③防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（pH值5-9），并要保持一定离子强度； ④防止核酸的生物降解； ⑤细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 ⑥进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 （四）RNA的提取 RNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。 常见方法（依据RNA的种类和来源）：①苯酚法（实验室最常用的方法）②去污剂法③盐酸胍法 实验室提取RNA的方法 （1）苯酚法：组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中， DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。 优点：较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。 （2）本实验提取RNA的原理及方法 原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白