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第二章 生物制药工艺技术基础Basis of biopharmaceutical technology;基因工程制药技术基础; 基因工程(genetic engineering)：外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。 基因工程操作过程： （1）获得目的基因； （2）构建DNA重组体； （3）将重组体导入宿主细胞； （4）工程菌的克隆与鉴定； （5）目的基因扩增与蛋白表达。 ;基因工程技术的应用特点： 为癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、药物和诊断试剂。 基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。; 基因工程技术生???药品的优点： 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障； 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造； 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 ;获得目的基因;培养工程菌;一 目的基因的制备; 克隆蛋白质药物基因的一个主要目的是为了高效的表达该基因，从而大量地生产原本难以获得的药物。 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。 进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。;宿主细胞的基本要求： ① 容易获得较高浓度的细胞； ② 能利用易得廉价原料； ③ 不致病、不产生内毒素； ④ 发热量低，需氧低； ⑤ 容易进行代谢调控； ⑥ 容易进行DNA技术操作； ⑦ 产物的产量高，且易提取纯化。; 原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等； 真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。 ;（1）大肠杆菌 Escherichia coli 优点：遗传背景清楚、技术操作简单，所需的成本相对 较低和高表达量。 缺点： 目的蛋白常以包涵体(inclusion body)形式表达，纯化提取困难。;（2）芽孢杆菌Bacillus：分泌能力强，不形成包含体。有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解。 （3）链霉菌Streptomyces：可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。;（1）酵母：表达产物能可进行折叠和翻译后修饰与糖基化，表达量高，产物易纯化。 （2）丝状真菌：很强的分泌能力；有成熟的发酵和后处理工艺。 ; ;工程菌的培养过程：摇瓶操作（温度、pH、培养基组分、碳氮比）； 培养罐操作（确定培养参数、控制方案、顺序） （一）、基因工程菌的培养方式： 1、分批培养（batch culture） 2、补料分批培养（fed-batch culture） 3、连续培养（continuous culture） 4、透析培养（dialysis culture）;（二）基因工程菌的发酵工艺; 基因工程药物分离纯化的一般流程; 六 基因工程药物的质量控制;（三）纯化工艺中的质量控制 1、产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA都控制在规定限度以下。 2、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。 （四）目标产品的质量控制 1、产品的鉴定 2、纯度分析 3、生物化学测定 4、稳定性考察 5、产品一致性的保证 ; 基因工程药物应用实例;治疗糖尿病的胰岛素，是一种 51 个氨基酸残基组成的蛋白质。 1982 年美国 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。 干扰素用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗