大鼠脊神经结扎术手术步骤.docxVIP

①位于双侧髂前上棘连线大约为L4/5横突后,手术周围5cm范围剃毛,常规消毒皮肤,铺孔巾。 ②以大鼠两骸前上脊连线的中点作中线,中线旁往左5mm,在L5-S1水平做一长约2cm的纵行切口,钝性分离皮下组织和椎旁肌肉。 ③钝性分离至暴露L6下关节突,充分显露L6横突。 ④用刮骨刀将L6横突周围的肌肉和结缔组织清除干净,暴露骨性结构。 ⑤用小咬骨钳小心的咬除L6横突,仔细的分离L6横突下的筋膜,暴露下方的L4和L5神经,L4和L5神经以一定的夹角并排行走,通常靠里靠下粗大的神经为L5,操作时避免触碰到L4神经。 （可以先找坐骨神经，3分支时，中间的是坐骨神经，4分支时。上2是坐骨神经） ⑥用玻璃分针将L5神经充分的游离出来,用镊子将6-0铬肠线穿过L5神经并紧紧的打上两个结,在线结远端5mm处将L5神经剪断。 ⑦用无菌生理盐水冲洗伤口,充分止血,擦干血渍,确认无活动性出血后,在伤口洒上链霉素粉防止术后伤口感染,逐???缝合伤口。 ⑧手术后将大鼠置于温暖干净的鼠笼中苏醒,并给予自由进食和饮水。 ⑨假手术组在进行套线后,不结扎剪断神经,其它步骤与手术组完全一样。 每天检查一次  后续 L5脊神经结扎的第十天,对大鼠行为学测试后,用戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉。打开胸腔,暴露其心脏,向左心室插入灌流针管,用止血钳将针管固定。用憐酸盐缓冲液(O.Olmol/LPBS, pH7.4)冲洗大鼠体内血液。再用4%多聚甲酸的磷酸盐缓冲液灌流、固定。待大鼠组织固定后,取脊髓腰膨大节段,放在4%多聚甲醛中4°C冰箱内固定4小时。后将脊髓转移到30%蔗糖溶液中,4°C冰箱脱水至组织下沉。用冰冻切片机切片,脊髓厚度为35tim。切好后将组织贴于载玻片上,放进一2(rc冰箱保存。用PBS冲洗切片三次,每次7 —10分钟。 然后孵育一抗二抗 4.2.1提取脊髓背角上蛋白 大鼠断头,取脊髓腰膨大处脊髓背角侧半,保留SNL侧。然后在装有液氮的碾钵中将组织碾磨成粉末状,移入EP管内,加入蛋白提取试剂,混合均勻放在冰上反应30min。后在髙速低温离心机下以14000 r/min转速离心30 min,取上清液移入另一个EP管中,对蛋白进行BCA定量,以每管45 ng蛋白分装。负80度冰箱保存。