实验室方法全集2012-12-20.docVIP

器官移植实验室实验操作规程 目 录  TOC \o 1-2 \h \z  HYPERLINK \l _Toc160635728 1 Western Blot Protocol  PAGEREF _Toc160635728 \h 1  HYPERLINK \l _Toc160635729 2 RT-PCR 的实验过程  PAGEREF _Toc160635729 \h 5  HYPERLINK \l _Toc160635730 3 细胞的冻存、复苏、传代和计数  PAGEREF _Toc160635730 \h 7  HYPERLINK \l _Toc160635731 4 外周血中提取DNA  PAGEREF _Toc160635731 \h 12  HYPERLINK \l _Toc160635732 5 组织中提取DNA  PAGEREF _Toc160635732 \h 13  HYPERLINK \l _Toc160635733 6 小鼠髓源性树突状细胞的提取和培养  PAGEREF _Toc160635733 \h 14  HYPERLINK \l _Toc160635734 7 细胞组织样品  PAGEREF _Toc160635734 \h 15  HYPERLINK \l _Toc160635735 8 原代培养人HSCs的表型确定  PAGEREF _Toc160635735 \h 18  HYPERLINK \l _Toc160635736 9 ELISA包被操作步骤：  PAGEREF _Toc160635736 \h 19  HYPERLINK \l _Toc160635737 10 鼠尾胶原制备方法  PAGEREF _Toc160635737 \h 20  HYPERLINK \l _Toc160635738 11 QIAEX II 试剂盒提取琼脂糖凝胶电泳DNA方法  PAGEREF _Toc160635738 \h 21  HYPERLINK \l _Toc160635739 12 Ltn重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定及鉴定  PAGEREF _Toc160635739 \h 22  HYPERLINK \l _Toc160635740 13 狭缝印迹杂交  PAGEREF _Toc160635740 \h 25  （生物医学技术发展迅速，请大家不要拘泥于手册，仅供实验准备工作参考） Western Blot Protocol 样品处理 1．培养细胞： ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2～3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵ 用细胞刮和移液器收集细胞，PBS漂洗2～3次，其间用低于1000rpm离心； ⑶ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上30～60min。 ⑷ 12000g离心，4℃，2min。 ⑸ 取少量上清进行定量。 ⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer（终浓度为1×）后，100℃ 3-5min变性即可上样检测，变形样品-20℃保存，两月内使用；未变性样品-70℃低温储存。 2．组织： ⑴ 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵ 12000g离心，4℃，2min。 ⑶ 取少量上清进行定量。 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer（终浓度为1×）后，100℃，5～10min变性，低温储存，-70℃低温储存。 裂解液配方： Tris-Cl (pH7.4) 20 mM EDTA 1 mM NaCl 150 mM Triton X-100 1%(v/v) 去氧胆酸钠 0.5％ cocktail 25ug/ml 提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4及NaF各 1mM。 4×loading buffer配方： 甘油 40% Tris·Cl (pH6.8) 200mM 溴酚蓝 0.4％ SDS 8% DTT 200mmol/L Buffer可配成2~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。 配胶 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干