大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法JinLab.doc

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法 (Jin Quan-Wen Lab at XMU) 一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备： 第一天： 1. 用枪头或接种环挑取单 HYPERLINK /Search.asp?Field=TitleClassID=keyword=克隆 克隆菌落，接种入盛有5ml LB液体培养基的 HYPERLINK /consumables/list.asp?sortid=7typeid=88 \t _blank 培养管中，可以准备两管。37?C，220rpm，培养过夜（14-16个小时）。 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个50ml离心管，以备第二天离心收集细菌用。 3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。 第二天： 取2-5ml过夜培养液，接入500ml LB (或2XTY)液体培养基中, 控制起始OD600 = 0,03-0,05。 37?C，220rpm，振摇2-4小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.4时，停止培养。 将菌液在冰上预冷30分钟。同时，开启离心机，预冷至4?C。 随后将菌液分装到250ml或500ml 预冷的离心瓶中，4?C，4000rpm离心15分钟。 弃上清液，先用少量（如20-50ml）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加水稀释至离心瓶的2/3体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）。4?C，4000rpm离心15分钟。 弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水中。4?C，4000rpm，离心15分钟。 弃上清，往离心管中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加10%甘油至终体积约为20ml。 4?C, 4000rpm, 离心10min。 小心弃去上清（沉淀可能会很松散!），加入2ml 10%甘油(灭菌，预冷)重悬浮细胞。 将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep HYPERLINK /consumables/list.asp?sortid=7typeid=88 \t _blank 离心管中，在液氮中快速冷冻后，于-70?C冰箱中保存。 检测转化效率：取100?l新鲜制备的感受态细胞，加入0.01ng已知浓度的plasmid DNA，电转化后，将重悬在1ml SOC培养液并复苏的细胞分别取10?l (1%)和100?l (10%)涂板，估测转化效率。 * Optimal efficiency is ca. 1X108 cfu/μg DNA for general cloning. ** For library transformation, efficiency with ca. 1X109 cfu/μg DNA is required. 感受态细胞制备简要流程： 收集细胞?冰水冲洗细胞2次?10%甘油冲洗细胞1次?重悬细胞在10%甘油?分装 二、电转化 [连接产物、纯化质粒或质粒文库]： 1．从-80?C冰箱中取出 HYPERLINK /reagent/list.asp?sortid=25typeid=298 \t _blank 感受态细胞，置于冰上解冻。 2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。 3．将解冻的 HYPERLINK /reagent/list.asp?sortid=25typeid=298 \t _blank 感受态细胞按照40～100ul/管转移至预冷的1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置。 4．取1-2 μl 纯化的质粒或克隆连接产物于1.5ml的 HYPERLINK /consumables/list.asp?sortid=7typeid=88 \t _blank 离心管中，冰上放置10min。[加入的DNA体积过大时，其中的盐会造成电击时产生电火花！] 5．打开电转仪[Bio-Rad Gene Pulser System]，调至Manual，调节参数设置为25 μF, 200 OHMs, 电压为2.0 kV [这些参数设置可以根据经验略作调整]。 6．将此混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部。用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。 7．将电击杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入2X 500?l的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。 8．37?C，220－250rpm复苏1小时。 9．离心，涂板，置于37?C，过夜培养，次日查看转化结果。 三、电击杯的清洗和保存： 1. 用清水将用过的电击杯稍微冲一下，向电击杯中加入75%酒精冲洗。 2．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10次以上。 3．