细胞增殖BrdU.docVIP

细胞增殖检测技术 -- BrdU法 基本原理 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）法检测细胞增殖原理：BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活细胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中（细胞周期S期）。这种掺入可以稳定存在，随着DNA复制进入子细胞中。 BrdU 特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。 操作步骤 （1）细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中（内放置一盖玻片），培养1 d，用含0.4％FBS培养液同步化3 d，使绝大多数细胞处于G0期。 （2）加入BrdU（储液：1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml），37℃，孵育40min。 （3）弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。 （4）甲醇/醋酸固定10 min。 （5）经固定的玻片空气干燥，0.3％H2O2 -甲醇30 min灭活内源性氧化酶。 （6）5％正常兔血清封闭。 （7）甲酰胺100℃，5 min变性核酸。 （8）冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。 （9）按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。 三、注意事项 1.BrdU配制方法：10 mg溶于10 ml双蒸水，4℃下避光保存 2.BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU粉尘。